腦死亡豬肝臟免疫性損傷機(jī)制及損傷防護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的： 肝移植是治療終末期肝病的最有效方法。然而供肝來(lái)源短缺使得很多終末期肝病患者在等待供肝過(guò)程中失去治療機(jī)會(huì)。我國(guó)人口基數(shù)較大，終末期肝病患者相對(duì)較多，器官短缺現(xiàn)象尤為突出，如能利用腦死亡供者(brain-dead donor，BDD)肝臟進(jìn)行移植，將是緩解供肝來(lái)源短缺的有效途徑之一。因此，對(duì)腦死亡狀態(tài)下肝臟形態(tài)與功能的變化進(jìn)行研究，可為將來(lái)有效利用腦死亡供肝提供理論依據(jù)。 以往研究表明腦死亡對(duì)肝臟具有損傷作用。

2、Olinga等在大鼠腦死亡動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究證實(shí)，腦死亡可導(dǎo)致肝組織IL-10、IL-1β mRNA上調(diào)，認(rèn)為其機(jī)制可能與枯否氏細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞激活有關(guān)。Van Der Hoeven等人在同樣的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)ICAM-1、VCAM-1、CD45陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞在腦死亡組動(dòng)物肝臟中均有表達(dá)，而對(duì)照組表達(dá)較少，推測(cè)這些炎癥介質(zhì)的表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與腦死亡有關(guān)。正是這種炎癥介質(zhì)的大量表達(dá)，易誘發(fā)移植器官與受體免疫系統(tǒng)相互作用，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而影響

3、移植后供體器官的近期與遠(yuǎn)期功能狀態(tài)。雖然大量研究表明腦死亡能引起肝臟功能形態(tài)的改變及炎癥性、免疫性損傷，但其具體機(jī)制尚不清楚。 核因子кB(nuclear factor KB，NF-кB)與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答密切相關(guān)，調(diào)控著細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞黏附分子等多種基因的表達(dá)。NF-кB過(guò)度激活是否為腦死亡致肝臟損傷的機(jī)制之一，尚待研究。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)是NF-

4、кB抑制劑，有可能減輕腦死亡狀態(tài)下肝臟的損傷。本研究擬利用長(zhǎng)白豬建立穩(wěn)定的腦死亡動(dòng)物模型，探討NF-кB在腦死亡狀態(tài)下肝臟損傷中的作用及PDTC對(duì)肝臟損傷的保護(hù)作用，以期為臨床更好地利用腦死亡供肝提供理論依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)共分三部分第一部分豬腦死亡模型建立及建立過(guò)程中血壓、心率變化目的采用改進(jìn)的緩慢間斷顱內(nèi)加壓法建立豬腦死亡模型，觀察建立過(guò)程中血壓、心率變化，為研究豬腦死亡狀態(tài)對(duì)肝臟形態(tài)、功能及免疫原性的影響提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

5、 方法 長(zhǎng)白豬12頭，雌雄不限，體質(zhì)量(25±4)kg。隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)和腦死亡組(B組)，每組6頭。C組維持麻醉24 h，僅行開(kāi)顱術(shù)并顱內(nèi)放置。Foley氣囊導(dǎo)管，不建立腦死亡模型；B組應(yīng)用改進(jìn)的緩慢間斷顱內(nèi)加壓法建立腦死亡模型，通過(guò)呼吸、循環(huán)支持維持豬腦死亡狀態(tài)24 h。監(jiān)測(cè)2組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中平均動(dòng)脈壓(mean artery pressure，MAP)、心率(heart rate，HR)等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)；B

6、組記錄腦電圖變化。應(yīng)用SPSS 11.5分析軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 結(jié)果 1 B組6頭豬均成功建立腦死亡模型。 2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中血壓、心率變化 2.1經(jīng)Foley氣囊導(dǎo)管緩慢間斷顱內(nèi)加壓后，B組動(dòng)物血壓、心率緩慢下降后驟然升高，呼吸頻率減慢、呼吸幅度加深，平均峰值動(dòng)脈壓(220.33±16.28 mmHg)和平均峰值心率(266.33±21.83次/分)與顱內(nèi)加壓前MAP(106.50±7.

7、26 mmHg)、HR(102.00±4.77次/分)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 2．2腦死亡后6、12和24 h，B組豬MAP和HR與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3 B組豬腦死亡前均出現(xiàn)“抽搐反應(yīng)”，表現(xiàn)為短暫的、無(wú)序性全身抽搐，心率、血壓驟升，腦電波受影響而呈現(xiàn)波形紊亂。 4 B 組豬腦死亡狀態(tài)下的生命體征均符合腦死亡供體的要求。經(jīng)呼吸和循環(huán)支持，B組豬腦死亡狀態(tài)可穩(wěn)定維持24

8、 h，達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，撤除呼吸機(jī)并停止循環(huán)支持，短時(shí)間內(nèi)腦死亡豬全部“心肺死亡”。 第二部分腦死亡對(duì)豬肝臟功能與形態(tài)的影響、影響機(jī)制及其損傷防護(hù) 目的 利用第一部分腦死亡模型，探討腦死亡對(duì)豬肝臟功能、形態(tài)的影響及核因子кB(nuclear factor KB，NF-кB)在其發(fā)生機(jī)制中的作用。并進(jìn)一步探討PDTC對(duì)其損傷的防護(hù)作用。 方法 長(zhǎng)白豬18頭，雌雄不限，體質(zhì)量(25±4)kg。隨機(jī)分為3

9、組，即對(duì)照組(C組)、腦死亡組(B組)及PDT℃處理組(P組)，每組6頭。C組維持麻醉24h，僅行開(kāi)顱顱內(nèi)放置Foley氣囊導(dǎo)管與開(kāi)關(guān)腹手術(shù)，不建立腦死亡； B組按照本論文第一部分所述方法制作腦死亡模型，但不行藥物干預(yù)；P組建立腦死亡，于確認(rèn)腦死亡后PDTC按15mg/kg加入100ml生理鹽水中，經(jīng)靜脈緩慢滴注。分別于腦死亡后6、12和24h開(kāi)腹取血清及肝臟組織，自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotra

10、nsferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartateaminotransferase，AST)水平，ELISA法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-1 β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polym

11、erase chain reaction，real-time PCR)法檢測(cè)肝組織NF-кB mRNA的變化；免疫組織化學(xué)方法觀察肝組織NF-кB p65蛋白表達(dá)水平；HE染色觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。應(yīng)用SPSS 11.5分析軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 第三部分腦死亡對(duì)豬肝臟免疫原性的影響及其機(jī)制 目的 利用第一部分腦死亡模型，探討腦死亡狀態(tài)對(duì)豬肝臟免疫原性的影響及NF-кB在其發(fā)生機(jī)制中的作用。并進(jìn)

12、一步探討PDTC對(duì)腦死亡豬肝臟免疫原性的影響。 方法 長(zhǎng)白豬18頭，雌雄不限，體質(zhì)量(25±4)kg。隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組(C組)、腦死亡組(B組)及PDTC處理組(P組)，每組6頭。模型建立及處理同論文第二部分，分別于腦死亡后6、12和24h開(kāi)腹取肝臟組織，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肝組織NF-кB、細(xì)胞間粘附因子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白1

13、(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)在基因水平的變化，免疫組織化學(xué)方法觀察肝組織NF-кB、ICAM-1、MCP-1、主要組織相容性抗原Ⅱ(major histocompatibility antigen Ⅱ，MHC-Ⅱ)蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用SPSS11.5分析軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 結(jié)果 1 腦死亡6、12和24 h肝組織NF-кB、ICAM-1、MCP01 mRN

14、A轉(zhuǎn)錄水平，C組各時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組及P組每后一時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2 腦死亡6、12和24 h肝組織NF-кB、ICAM-1、MCP-1、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)水平，C組各時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組及P組每后一時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組各對(duì)應(yīng)時(shí)間

15、點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 1 應(yīng)用改進(jìn)的緩慢間斷顱內(nèi)加壓法可成功制作豬腦死亡模型，經(jīng)有效的呼吸和循環(huán)支持，能穩(wěn)定地維持豬腦死亡狀態(tài)24h，明顯提高了模型制作成功率，為進(jìn)一步研究腦死亡狀態(tài)下豬肝臟形態(tài)和功能變化提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 2 豬腦死亡前均出現(xiàn)“抽搐反應(yīng)”，初步認(rèn)為這一現(xiàn)象的消失可作為腦死亡的判定指標(biāo)之一。 3 腦死亡導(dǎo)致豬肝臟出現(xiàn)功能與形態(tài)學(xué)的損傷性變化，機(jī)體TNF-α、IL-

16、1β、IL-6等炎癥介質(zhì)的合成與釋放增加。其機(jī)制可能是腦死亡引起肝細(xì)胞NF-кB mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體炎癥介質(zhì)合成與釋放。 4 腦死亡后豬肝臟NF-кB、ICAM-1、MCP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平均升高，肝臟組織MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)增多，肝臟免疫原性增強(qiáng)。可能的機(jī)制為腦死亡引起肝細(xì)胞NF-кB的活化，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體炎癥介質(zhì)水平升高及肝臟免疫原性增強(qiáng)。 5 腦死亡豬經(jīng)PDTC處理后，肝臟組織N

17、F-кB mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平均降低，炎癥介質(zhì)的釋放減少，肝臟炎性損傷減輕。 6 腦死亡豬經(jīng)PDTC處理后，肝臟組織NF-кB、ICAM-1、MCP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平均下降，肝臟組織MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)減少，肝臟免疫原性降低。 7 PDTC減輕肝損傷的機(jī)制可能是其抑制了NF-кB的活化，降低了腦死亡狀態(tài)下機(jī)體炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、免疫分子的釋放，降低了腦死亡狀態(tài)下豬肝臟的免疫原性，并最終保護(hù)了腦死亡狀態(tài)下