腦死亡豬肝臟免疫性損傷機制及損傷防護的實驗研究.pdf

1、背景和目的： 肝移植是治療終末期肝病的最有效方法。然而供肝來源短缺使得很多終末期肝病患者在等待供肝過程中失去治療機會。我國人口基數(shù)較大，終末期肝病患者相對較多，器官短缺現(xiàn)象尤為突出，如能利用腦死亡供者(brain-dead donor，BDD)肝臟進(jìn)行移植，將是緩解供肝來源短缺的有效途徑之一。因此，對腦死亡狀態(tài)下肝臟形態(tài)與功能的變化進(jìn)行研究，可為將來有效利用腦死亡供肝提供理論依據(jù)。 以往研究表明腦死亡對肝臟具有損傷作用。

2、Olinga等在大鼠腦死亡動物實驗中研究證實，腦死亡可導(dǎo)致肝組織IL-10、IL-1β mRNA上調(diào)，認(rèn)為其機制可能與枯否氏細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞激活有關(guān)。Van Der Hoeven等人在同樣的動物模型中發(fā)現(xiàn)ICAM-1、VCAM-1、CD45陽性T淋巴細(xì)胞在腦死亡組動物肝臟中均有表達(dá)，而對照組表達(dá)較少，推測這些炎癥介質(zhì)的表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤與腦死亡有關(guān)。正是這種炎癥介質(zhì)的大量表達(dá)，易誘發(fā)移植器官與受體免疫系統(tǒng)相互作用，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而影響

3、移植后供體器官的近期與遠(yuǎn)期功能狀態(tài)。雖然大量研究表明腦死亡能引起肝臟功能形態(tài)的改變及炎癥性、免疫性損傷，但其具體機制尚不清楚。 核因子кB(nuclear factor KB，NF-кB)與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答密切相關(guān)，調(diào)控著細(xì)胞因子、生長因子及細(xì)胞黏附分子等多種基因的表達(dá)。NF-кB過度激活是否為腦死亡致肝臟損傷的機制之一，尚待研究。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)是NF-

4、кB抑制劑，有可能減輕腦死亡狀態(tài)下肝臟的損傷。本研究擬利用長白豬建立穩(wěn)定的腦死亡動物模型，探討NF-кB在腦死亡狀態(tài)下肝臟損傷中的作用及PDTC對肝臟損傷的保護作用，以期為臨床更好地利用腦死亡供肝提供理論依據(jù)。 本實驗共分三部分第一部分豬腦死亡模型建立及建立過程中血壓、心率變化目的采用改進(jìn)的緩慢間斷顱內(nèi)加壓法建立豬腦死亡模型，觀察建立過程中血壓、心率變化，為研究豬腦死亡狀態(tài)對肝臟形態(tài)、功能及免疫原性的影響提供穩(wěn)定的實驗動物模型。

5、 方法 長白豬12頭，雌雄不限，體質(zhì)量(25±4)kg。隨機分為對照組(C組)和腦死亡組(B組)，每組6頭。C組維持麻醉24 h，僅行開顱術(shù)并顱內(nèi)放置。Foley氣囊導(dǎo)管，不建立腦死亡模型；B組應(yīng)用改進(jìn)的緩慢間斷顱內(nèi)加壓法建立腦死亡模型，通過呼吸、循環(huán)支持維持豬腦死亡狀態(tài)24 h。監(jiān)測2組動物在實驗過程中平均動脈壓(mean artery pressure，MAP)、心率(heart rate，HR)等血流動力學(xué)參數(shù)；B

6、組記錄腦電圖變化。應(yīng)用SPSS 11.5分析軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計處理。 結(jié)果 1 B組6頭豬均成功建立腦死亡模型。 2 實驗過程中血壓、心率變化 2.1經(jīng)Foley氣囊導(dǎo)管緩慢間斷顱內(nèi)加壓后，B組動物血壓、心率緩慢下降后驟然升高，呼吸頻率減慢、呼吸幅度加深，平均峰值動脈壓(220.33±16.28 mmHg)和平均峰值心率(266.33±21.83次/分)與顱內(nèi)加壓前MAP(106.50±7.

7、26 mmHg)、HR(102.00±4.77次/分)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 2．2腦死亡后6、12和24 h，B組豬MAP和HR與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3 B組豬腦死亡前均出現(xiàn)“抽搐反應(yīng)”，表現(xiàn)為短暫的、無序性全身抽搐，心率、血壓驟升，腦電波受影響而呈現(xiàn)波形紊亂。 4 B 組豬腦死亡狀態(tài)下的生命體征均符合腦死亡供體的要求。經(jīng)呼吸和循環(huán)支持，B組豬腦死亡狀態(tài)可穩(wěn)定維持24

8、 h，達(dá)到預(yù)定時間后，撤除呼吸機并停止循環(huán)支持，短時間內(nèi)腦死亡豬全部“心肺死亡”。 第二部分腦死亡對豬肝臟功能與形態(tài)的影響、影響機制及其損傷防護 目的 利用第一部分腦死亡模型，探討腦死亡對豬肝臟功能、形態(tài)的影響及核因子кB(nuclear factor KB，NF-кB)在其發(fā)生機制中的作用。并進(jìn)一步探討PDTC對其損傷的防護作用。 方法 長白豬18頭，雌雄不限，體質(zhì)量(25±4)kg。隨機分為3

9、組，即對照組(C組)、腦死亡組(B組)及PDT℃處理組(P組)，每組6頭。C組維持麻醉24h，僅行開顱顱內(nèi)放置Foley氣囊導(dǎo)管與開關(guān)腹手術(shù)，不建立腦死亡； B組按照本論文第一部分所述方法制作腦死亡模型，但不行藥物干預(yù)；P組建立腦死亡，于確認(rèn)腦死亡后PDTC按15mg/kg加入100ml生理鹽水中，經(jīng)靜脈緩慢滴注。分別于腦死亡后6、12和24h開腹取血清及肝臟組織，自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotra

10、nsferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartateaminotransferase，AST)水平，ELISA法檢測血清白細(xì)胞介素-1 β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平；實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polym

11、erase chain reaction，real-time PCR)法檢測肝組織NF-кB mRNA的變化；免疫組織化學(xué)方法觀察肝組織NF-кB p65蛋白表達(dá)水平；HE染色觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。應(yīng)用SPSS 11.5分析軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計處理。 第三部分腦死亡對豬肝臟免疫原性的影響及其機制 目的 利用第一部分腦死亡模型，探討腦死亡狀態(tài)對豬肝臟免疫原性的影響及NF-кB在其發(fā)生機制中的作用。并進(jìn)

12、一步探討PDTC對腦死亡豬肝臟免疫原性的影響。 方法 長白豬18頭，雌雄不限，體質(zhì)量(25±4)kg。隨機分為3組，即對照組(C組)、腦死亡組(B組)及PDTC處理組(P組)，每組6頭。模型建立及處理同論文第二部分，分別于腦死亡后6、12和24h開腹取肝臟組織，實時熒光定量PCR法檢測肝組織NF-кB、細(xì)胞間粘附因子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白1

13、(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)在基因水平的變化，免疫組織化學(xué)方法觀察肝組織NF-кB、ICAM-1、MCP-1、主要組織相容性抗原Ⅱ(major histocompatibility antigen Ⅱ，MHC-Ⅱ)蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用SPSS11.5分析軟件，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計處理。 結(jié)果 1 腦死亡6、12和24 h肝組織NF-кB、ICAM-1、MCP01 mRN

14、A轉(zhuǎn)錄水平，C組各時間點比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組及P組每后一時間點與前一時間點比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3組各對應(yīng)時間點比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 2 腦死亡6、12和24 h肝組織NF-кB、ICAM-1、MCP-1、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)水平，C組各時間點比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組及P組每后一時間點與前一時間點比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3組各對應(yīng)時間

15、點比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 1 應(yīng)用改進(jìn)的緩慢間斷顱內(nèi)加壓法可成功制作豬腦死亡模型，經(jīng)有效的呼吸和循環(huán)支持，能穩(wěn)定地維持豬腦死亡狀態(tài)24h，明顯提高了模型制作成功率，為進(jìn)一步研究腦死亡狀態(tài)下豬肝臟形態(tài)和功能變化提供了堅實基礎(chǔ)。 2 豬腦死亡前均出現(xiàn)“抽搐反應(yīng)”，初步認(rèn)為這一現(xiàn)象的消失可作為腦死亡的判定指標(biāo)之一。 3 腦死亡導(dǎo)致豬肝臟出現(xiàn)功能與形態(tài)學(xué)的損傷性變化，機體TNF-α、IL-

16、1β、IL-6等炎癥介質(zhì)的合成與釋放增加。其機制可能是腦死亡引起肝細(xì)胞NF-кB mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致機體炎癥介質(zhì)合成與釋放。 4 腦死亡后豬肝臟NF-кB、ICAM-1、MCP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平均升高，肝臟組織MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)增多，肝臟免疫原性增強?？赡艿臋C制為腦死亡引起肝細(xì)胞NF-кB的活化，進(jìn)而導(dǎo)致機體炎癥介質(zhì)水平升高及肝臟免疫原性增強。 5 腦死亡豬經(jīng)PDTC處理后，肝臟組織N

17、F-кB mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平均降低，炎癥介質(zhì)的釋放減少，肝臟炎性損傷減輕。 6 腦死亡豬經(jīng)PDTC處理后，肝臟組織NF-кB、ICAM-1、MCP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平均下降，肝臟組織MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)減少，肝臟免疫原性降低。 7 PDTC減輕肝損傷的機制可能是其抑制了NF-кB的活化，降低了腦死亡狀態(tài)下機體炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、免疫分子的釋放，降低了腦死亡狀態(tài)下豬肝臟的免疫原性，并最終保護了腦死亡狀態(tài)下