Runx1在腦死亡供體肝臟中作用機(jī)制研究.pdf

1、第一章兔腦死亡肝臟差異蛋白表達(dá)趨勢(shì)檢測(cè)
　　目的：根據(jù)前期蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出的顯著性差異蛋白R(shí)unx1，研究其在腦死亡肝臟中表達(dá)趨勢(shì)變化。
　　方法：使用免疫組化、PCR、western blot在轉(zhuǎn)錄翻譯水平驗(yàn)證Runx1蛋白在腦死亡肝臟中表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：免疫組化、RT-PCR、Western blot檢測(cè)腦死亡后Runx1蛋白在肝臟中表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)隨著腦死亡持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，Runx1蛋白呈下降趨勢(shì)，在

2、8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平最低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：緩慢間斷顱內(nèi)加壓法腦死亡后肝臟采用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析，鑒定出Runx1蛋白表達(dá)水平在腦死亡前后肝臟細(xì)胞中有顯著變化，該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，是細(xì)胞增殖與分化相關(guān)蛋白質(zhì)，隨著腦死亡時(shí)間的延長(zhǎng)，在肝臟中的表達(dá)逐漸減少，可能參與致肝臟損傷過(guò)程。
　　第二章 Runx1蛋白對(duì)缺血缺氧肝臟細(xì)胞作用的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索Runx1蛋白對(duì)缺血缺氧肝臟細(xì)胞的作

3、用。
　　方法：使用質(zhì)粒為載體的全長(zhǎng)度Runx1 eDNA pEGFP-N1-RUNX1轉(zhuǎn)染大鼠肝臟，使Runx1基因過(guò)表達(dá);轉(zhuǎn)染pEGFP-N1為陰性對(duì)照組，對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的大鼠肝臟細(xì)胞進(jìn)行缺血缺氧處理;實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組（C組）、缺血缺氧組(IS)、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照+缺血缺氧組(S+IS)、Runx1過(guò)表達(dá)+缺血缺氧組(OS+IS)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠肝臟的細(xì)胞凋亡率，檢測(cè)TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表

4、達(dá)水平，研究Runx1蛋白對(duì)缺血缺氧細(xì)胞肝臟作用機(jī)制。
　　結(jié)果：pEGFP-N1-RUNX1轉(zhuǎn)染大鼠肝臟細(xì)胞48小時(shí)后Rux1蛋白表達(dá)水平達(dá)到峰值。PCR和Western blot檢測(cè)Runx1表達(dá)水平在IS組和S+IS組較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，在OS+IS組較對(duì)照組表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，IS組和S+IS組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡明顯升高(P＜0.01)，OS+IS組細(xì)胞凋亡率較IS組和S

5、+IS組明顯降低(P＜0.05)。PCR檢測(cè)大鼠肝臟細(xì)胞各組TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表達(dá)水平。在IS組、S+IS組、OS+IS組中，TGF-β mRNA表達(dá)水平全部升高(P＜0.05)，三組之間沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)。在IS組和S+IS組中，Bcl-2 mRNA與C組相比表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，但兩組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，Bim、TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);在OS+

6、IS組中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，Bim、TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。Runx1表達(dá)水平的改變引起了Bcl-2/Bim、TNF-α mRNA表達(dá)水平的顯著改變，因此Bcl-2/Bim、TNF-α是受到Runx1蛋白調(diào)控的下游信號(hào)分子。
　　結(jié)論：體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肝臟細(xì)胞在缺血缺氧后，Runx1明顯降低，TGF-β、Bim、TNF-α等細(xì)胞凋亡相關(guān)因子明顯升高;采用pEGFP-

7、N1-RUNX1真核載體轉(zhuǎn)染方法可有效的使Runx1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)增加。過(guò)表達(dá)Runx1后，TGF-β表達(dá)含量無(wú)明顯變化，而B(niǎo)cl-2、Bim、TNF-α等凋亡相關(guān)因子表達(dá)顯著變化;過(guò)表達(dá)Runx1后細(xì)胞凋亡率顯著降低，這與Runx1誘導(dǎo)凋亡抑制因子Bcl-2升高并使得促凋亡因子Bim、TNF-α表達(dá)降低有關(guān)。Runx1是通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bim家族表達(dá)，經(jīng)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;同時(shí)，Runx1促進(jìn)TNF-α表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞

8、外凋亡途徑引起細(xì)胞凋亡;
　　第三章 Runx1蛋白對(duì)腦死亡大鼠肝臟細(xì)胞作用機(jī)制的在體實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：通過(guò)腦死亡大鼠在體實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信號(hào)通路對(duì)腦死亡肝臟細(xì)胞作用機(jī)制。
　　方法：高壓注射質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠尾靜脈pEGFP-N1-RUNX1，并實(shí)行腦死亡手術(shù)。將實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組（C組）、腦死亡組(BD)、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照+腦死亡組(S+BD)、

9、Runx1過(guò)表達(dá)+腦死亡組(OS+BD)。檢測(cè)各組肝臟在2h、4h、6h、8h時(shí)間點(diǎn)ALT、AST水平和肝臟形態(tài)學(xué)變化，以觀察各組肝臟功能損傷;PCR檢測(cè)各組2h、4h、8h時(shí)間點(diǎn)Runx1、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表達(dá)水平，驗(yàn)證Runx1對(duì)肝臟作用機(jī)制。
　　結(jié)果：高壓注射質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠尾靜脈pEGFP-N1-RUNX1在48小時(shí)后Runx1表達(dá)達(dá)到峰值，后逐漸下降。檢測(cè)各組ALT、AST水平，與對(duì)照組

10、相比，BD組與S+BD組ALT、AST的水平明顯升高(P＜0.05)，但兩組間相差無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);OS+BD組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中ALT、AST水平較BD組與S+BD組降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。肝臟形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示，與BD組相比，OS+BD組各時(shí)間點(diǎn)肝臟細(xì)胞損傷程度均減輕。PCR檢測(cè)大鼠肝臟細(xì)胞假手術(shù)組（C組）、腦死亡組(BD)、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照+腦死亡組(S+BD)、Runx1過(guò)表達(dá)+腦死亡組(OS+BD)中2

11、h、4h、8h時(shí)間點(diǎn)Runx1、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表達(dá)水平，GAPDH為參照。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，腦死亡組(BD)、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照+腦死亡組(S+BD)、Runx1過(guò)表達(dá)+腦死亡組(OS+BD)TGF-βmRNA表達(dá)水平升高，三組處理方式間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相比，腦死亡組(BD)、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照+腦死亡組(S+BD) Bcl-2 mRNA表達(dá)水平降低，Bim、TNF-α表達(dá)水平升

12、高(P＜0.05);而Runx1過(guò)表達(dá)+腦死亡組(OS+BD)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，而B(niǎo)im、TNF-α表達(dá)水平降低(P＜0.05)，相對(duì)應(yīng)肝臟形態(tài)學(xué)，肝臟細(xì)胞壞死凋亡面積減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。
　　結(jié)論：Runx1在體大鼠腦死亡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Runx1在腦死亡肝臟中表達(dá)含量的降低，引起肝臟細(xì)胞凋亡增加;Runx1對(duì)肝臟細(xì)胞的作用是通過(guò)TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信