大鼠腦死亡腎臟損傷和保護(hù)及腦-心雙死亡供者器官捐獻(xiàn)臨床實(shí)踐.pdf

1、作為最成熟的器官移植，同種異體腎移植在近十幾年內(nèi)已成為首選的腎臟替代治療手段[1]，在存活時間、生存質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益比等方面均優(yōu)于透析治療。然而，供體器官短缺嚴(yán)重限制了我國腎移植規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大。擴(kuò)大供腎來源是我國乃至全球腎移植臨床進(jìn)一步發(fā)展的重要課題。腦死亡供體器官捐獻(xiàn)對于我國腎移植臨床事業(yè)進(jìn)一步發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。目前，我國大量腦死亡患者的器官未得到利用，每年約13萬人死于車禍，因各種疾病在醫(yī)院處于腦死亡狀態(tài)的患者數(shù)目更加龐大。因此，腦死

2、亡供體腎移植將是我國器官移植領(lǐng)域重要的研究方向，并具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　作為復(fù)雜的病理進(jìn)程，腦死亡對于腎臟的損傷機(jī)制尚不完全清楚。目前已知腦死亡可引起腎臟組織內(nèi)微循環(huán)和能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)加重、免疫狀態(tài)增強(qiáng)、補(bǔ)體系統(tǒng)活化以及氧化應(yīng)激損傷等[4，7]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、腎臟超微結(jié)構(gòu)和組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)損傷及其功能改變。腦死亡產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)，血流動力學(xué)不穩(wěn)定導(dǎo)致缺血再灌注，兩者均是腎臟損傷的重要機(jī)制[8,9]。探討腦死亡狀態(tài)下炎癥反應(yīng)

3、和缺血再灌注等病理過程對腎臟的損傷機(jī)制，對于評估供腎質(zhì)量、預(yù)測腎移植療效以及指導(dǎo)靶向保護(hù)治療等具有重要意義。本研究通過建立大鼠腦死亡模型評估腦死亡對腎臟的損傷，并動態(tài)觀察腦死亡過程中的氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的信號通路，為腦死亡供體腎移植的相關(guān)臨床診斷與治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在此研究基礎(chǔ)上，本研究還首次采用我國中草藥植物提取物—淫羊藿甙以及特異性MAPKs信號通路抑制劑SB203580處理腦死亡供體和腎移植受體，對供腎起到了較好的

4、保護(hù)作用，也取得了較好的腎移植療效。
　　目前中國全國性的器官捐獻(xiàn)系統(tǒng)的缺失導(dǎo)致了移植用器官的嚴(yán)重不足，在動物研究的基礎(chǔ)上，建立一個國家層面的器官捐獻(xiàn)體系勢在必行。2010年衛(wèi)生部聯(lián)合中國紅十字會決定以省紅十字為單位開展心臟死亡器官捐獻(xiàn)。河南省紅十字會在無償獻(xiàn)血、造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)及遺體捐獻(xiàn)有豐富的經(jīng)驗(yàn)，在過去這些年使數(shù)萬人受益。它在河南每個地市都有分支機(jī)構(gòu)，擁有數(shù)百工作人員和幾千名志愿者。同時，河南省作為一個人口大省有1億多人，據(jù)估

5、計(jì)有近十萬終末期器官衰竭患者需要器官移植。為了緩解巨大的器官缺口，在取得河南省衛(wèi)生廳的支持后，HRC開始進(jìn)行器官捐獻(xiàn)試點(diǎn)的探索工作，本研究第二部分就我省首批23例腦心雙死亡捐獻(xiàn)器官的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)。
　　第一部分
　　大鼠腦死亡狀態(tài)下腎臟損傷機(jī)制探討
　　目的:研究大鼠腦死亡狀態(tài)下腎臟損傷機(jī)制
　　方法:
　　1.根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)建立大鼠穩(wěn)定型腦死亡模型[10-12]。
　　2.按照我們的方法建立大鼠同

6、種異體原位腎移植模型[13]。
　　3.采用Fisher344大鼠作為供體。按照上述步驟建立大鼠腦死亡模型，維持腦死亡狀態(tài)3h后，切取左側(cè)腎臟作為供體器官。
　　4.采用Lewis大鼠作為腎移植受體，F(xiàn)isher344大鼠作為供體，進(jìn)行同種異體原位腎移植。
　　5.在誘導(dǎo)腦死亡前(0h)以及誘導(dǎo)腦死亡后2h、4h、6h處死SD大鼠，經(jīng)腹主動脈抽取外周血，室溫靜置30min后離心(10000g，20min)，吸取上層血清

7、凍存，用于生化檢查。
　　6.大鼠誘導(dǎo)腦死亡后，持續(xù)監(jiān)測血壓、心率。收集所有血清標(biāo)本后，測定尿素氮和肌酐。采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子水平。
　　7.用制備的cDNA標(biāo)本，采用實(shí)時熒光定量PCR測定腎組織內(nèi)炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)、趨化因子(MCP-1、MIP-2、IP-10)、轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、ATF3），以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax)等

8、的mRNA表達(dá)水平。
　　8.采用western免疫印跡法測定腎組織內(nèi)p38-MAPK、ERK1/2、JNK等蛋白的磷酸化水平，測定腎組織內(nèi)ATF3蛋白表達(dá)水平。
　　9.采用試劑盒測定組織髓過氧化物酶(MPO)活性（反映中性粒細(xì)胞浸潤）以及丙二醛含量等。采用蘇木素-伊紅(H&E)染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，用普通光學(xué)顯微鏡在400倍光鏡下，隨機(jī)選取5個視野，每個視野選擇10個腎小管計(jì)分，光鏡下腎小管病變程度采用Paller氏標(biāo)

9、準(zhǔn)評分(表2-4)。
　　10.丙二醛含量測定:采用硫代巴比妥酸法。
　　結(jié)果:
　　1.SD大鼠在誘導(dǎo)腦死亡后2h、4h、6h血清尿素氮、肌酐水平明顯升高，與0h相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。并且隨著腦死亡時間的延長，血清尿素氮和血清肌酐水平逐漸升高，各時間點(diǎn)之間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　2.大鼠腎組織內(nèi)ATF3mRNA隨腦死亡時間延長而逐漸升高2.6～4.2倍，6h時最高;ATF3蛋白表

10、達(dá)水平呈現(xiàn)出相似趨勢，6h時增至3.4倍;ERK、JNK和p38MAPK蛋白磷酸化水平增加;p-ERK在4h達(dá)高峰，6h時降低;p-JNK在4h和6h水平相近;p-p38在6h時最高。STAT3蛋白磷酸化水平隨腦死亡時間延長而增加;大鼠腎臟組織內(nèi)促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平明顯升高，并在腦死亡后6h內(nèi)呈時間依賴趨勢。巨噬細(xì)胞趨化因子MCP-1、MIP-2、IP-10等mRNA表達(dá)水平在

11、腦死亡4h后開始較明顯升高，6h時達(dá)到高峰。
　　3.腎臟組織內(nèi)炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的mRNA表達(dá)水平逐漸升高，在4h左右達(dá)到高峰，6h時略有降低。采用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細(xì)胞因子的水平。IL-6水平顯著升高。TNF-α水平未見明顯升高;IL-1β水平升高不明顯。腦死亡后腎組織內(nèi)Bax/Bcl-2比值明顯升高，并呈時間依賴性。大鼠腦死亡后腎組織內(nèi)MPO含量明顯升高，并呈時間依賴性;腎組

12、織內(nèi)MDA含量升高也很明顯(p＜0.01)。
　　4.組織病理學(xué)檢查顯示，腦死亡6h后腎臟呈現(xiàn)明顯的病理損傷。。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立大鼠穩(wěn)定型腦死亡模型以及大鼠同種異體原位腎移植模型。
　　2.SD大鼠在誘導(dǎo)腦死亡后與誘導(dǎo)腦死亡前2h、4h、6h，血清尿素氮、肌酐水平明顯升高。并且隨著腦死亡時間的延長，血清尿素氮和血清肌酐水平逐漸升高。
　　3.記錄了腦死亡過程中的氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的

13、信號通路數(shù)據(jù)，為腦死亡供體腎移植的相關(guān)臨床診斷與治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第二部分淫羊藿甙和p38-MAPK特異性抑制劑對腦死亡供腎損傷的保護(hù)作用
　　目的:研究淫羊藿甙和p38-MAPK特異性抑制劑對腦死亡供腎損傷的保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.采用Fisher344大鼠建立腦死亡模型。
　　2.誘導(dǎo)腦死亡后腹腔注射淫羊藿甙(100mg/kg/day)或p38-MAPK特異性抑制劑—SB203580(

14、1mg/kg/day)，或兩者聯(lián)合用藥。
　　3.維持腦死亡3h后，處死大鼠按照上述供體腎臟準(zhǔn)備程序取出腎臟作為供體。
　　4.準(zhǔn)備好供體腎臟后，立即以Lewis大鼠為受體，建立同種異體腎移植模型。
　　5.手術(shù)當(dāng)天(day0)及術(shù)后一周內(nèi)每天給予淫羊藿甙(100mg/kg/day)或SB203580(1mg/kg/day)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組和制定給藥方案。觀察各組移植物存活時間，檢測相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。
　　結(jié)果:<

15、br>　　1.淫羊藿甙、SB203580處理后，腦死亡供腎移植的移植物存活時間（中位數(shù)）從31.5天、36天延長至53.5天、52.5天;兩者聯(lián)合處理后，移植物存活時間（中位數(shù)）從35天延長至97.5天，50％的移植腎存活超過100天。
　　2.腎移植術(shù)后第10天，淫羊藿甙組、SB203580組及聯(lián)合處理組的移植腎功能較對照組有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　3.按照Banff分級標(biāo)準(zhǔn)，分別從腎小球炎、腎小管病

16、變、血管炎以及間質(zhì)纖維化等方面對腦死亡供腎的組織病理學(xué)改變進(jìn)行評分，每組各取3只大鼠，表3-1中所示為相應(yīng)病理表現(xiàn)的動物數(shù)量。與各對照組比較，經(jīng)淫羊藿甙或SB203580處理后，血管炎減輕最明顯，腎小管萎縮也有所改善。血管炎和腎小管萎縮在聯(lián)合處理組改善最明顯。與對照組比較，藥物處理組的間質(zhì)纖維化改善不明顯。
　　結(jié)論:
　　1.淫羊藿甙可明顯延長腦死亡供腎移植的移植物存活時間，對供腎起到了較好的保護(hù)作用。
　　2.SB

17、203580可明顯延長腦死亡供腎移植的移植物存活時間，對供腎起到了較好的保護(hù)作用。
　　3.兩者聯(lián)合處理后，移植物存活時間（中位數(shù)）比單獨(dú)應(yīng)用淫羊藿甙、SB203580處理后腦死亡供腎移植的移植物存活時間（中位數(shù)）明顯延長。
　　第三部分河南省腦死亡加心死亡供者器官捐獻(xiàn)23例總結(jié)
　　目的:總結(jié)河南省腦死亡加心死亡(Donationafterbraindeathandcardiacdeath，DBCD)器官捐獻(xiàn)中的經(jīng)驗(yàn)

18、，探索中國器官捐獻(xiàn)的規(guī)范化模式。
　　方法:
　　聯(lián)合河南省紅十字會及衛(wèi)生廳建立器官捐獻(xiàn)辦公室，以中國三型腦-心雙死亡為死亡標(biāo)準(zhǔn)，參照國家相關(guān)組織架構(gòu)建立組織，采取多種宣傳方法，以紅十字會工作人員組成的協(xié)調(diào)員隊(duì)伍為核心，以《中國心臟死亡器官捐獻(xiàn)指南》為行動標(biāo)準(zhǔn)，在河南地區(qū)開展人體器官捐獻(xiàn)工作。
　　結(jié)果:
　　1.自2010年7月1日至2012年9月30日，河南省器官捐獻(xiàn)辦公室收到有效器官捐獻(xiàn)申請書1000余份。

19、共接到符合標(biāo)準(zhǔn)的潛在DCD供者申請95例。潛在供者原發(fā)病主要為交通意外外傷（51/95，53.7％）、其他意外外傷（17/95，17.9％）、自發(fā)性腦出血（15/95，15.8％）及頭顱腫瘤（5/95，5.3％）及其他（6/95，6.3％）;獲知器官捐獻(xiàn)的途徑主要為協(xié)調(diào)員告知(69/95，72.6％)及由媒體或宣傳品獲得（26/95，27.4％）。沒有成功案例72例，原因包括家屬同意后反悔（32/72，44.4％）、與交通部門、醫(yī)院行政

20、部門協(xié)調(diào)問題（15/72，20.8％）、家屬中有人反對(9/72，12.5％)、嚴(yán)格醫(yī)學(xué)檢查不符合腦死亡（7/72，9.7％）、嚴(yán)重器官功能衰竭(6/72，8.3％)和供者突然死亡（3/72，4.2％）。家屬意見不一致的9例患者中，2例潛在捐獻(xiàn)者家屬同意患者死亡后捐獻(xiàn)角膜。
　　2.成功實(shí)施DCD器官捐獻(xiàn)23例（23/95，24.2％）及遺體角膜捐獻(xiàn)2例，共捐獻(xiàn)肝臟18個，腎臟44個，胰腺1個，角膜16個，分流至5家醫(yī)院的6個移植

21、中心，所有手術(shù)均順利完成。23例成功捐獻(xiàn)案例的原發(fā)病以腦外傷為主(60％);
　　3.我院完成DCD腎臟移植23例，手術(shù)均順利完成，術(shù)后免疫抑制方案均為他克莫司、驍悉聯(lián)合強(qiáng)的松，一例患者術(shù)后早期發(fā)生急性排斥反應(yīng)后移植腎破裂大出血，給予切除移植腎并行再次腎移植術(shù)，15天后患者死于DIC;腎臟移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率為4/23，移植腎臟延遲回復(fù)發(fā)生率為7/23。
　　結(jié)論:
　　我們按照國家相關(guān)規(guī)定，在河南探索建立了一個