Salubrinal減輕大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的分子機(jī)制研究.pdf

1、肝臟移植是治療終末期肝臟疾病最有效的治療途徑。制約肝臟移植發(fā)展的最主要因素是肝臟供體的短缺。腦死亡供體是肝臟移植的主要供體來(lái)源。腦死亡是指包括腦干功能在內(nèi)的全腦功能不可逆和永久的喪失。腦死亡是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，是一個(gè)直接影響器官形態(tài)和功能的動(dòng)態(tài)過(guò)程。研究表明腦死亡來(lái)源的供體較活體來(lái)源的供體移植術(shù)后并發(fā)癥多、生存率低。因此，腦死亡被認(rèn)為是造成供體器官損傷的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。細(xì)胞凋亡的增加是導(dǎo)致腦死亡供體肝臟損傷的主要因素。
　

2、　引起細(xì)胞凋亡的途徑有三條，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引起凋亡是線(xiàn)粒體途徑和外源性途徑之外的第三條凋亡途徑。通常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)保護(hù)由外界刺激對(duì)細(xì)胞的損傷，但是當(dāng)應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)或者應(yīng)激強(qiáng)度增大，不能通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)保護(hù)機(jī)制代償，最終會(huì)通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路引起細(xì)胞凋亡。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類(lèi)似激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)后，通過(guò)

3、磷酸化真核生物的翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor2α,eIF2α）,介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Salubrinal可通過(guò)選擇性誘導(dǎo)eIF2α磷酸化和抑制其去磷酸化來(lái)對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERs）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且其不保護(hù)與ERs無(wú)關(guān)的細(xì)胞凋亡刺激。研究表明Salubrinal能減輕細(xì)胞的凋亡。
　　因此，研究應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

4、誘導(dǎo)凋亡抑制劑對(duì)腦死亡肝臟損傷的影響，有利于闡明腦死亡對(duì)肝臟損傷的機(jī)制，為腦死亡下器官功能的保護(hù)奠定理論基礎(chǔ)和提供藥物靶點(diǎn)。
　　目的：
　　探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal對(duì)大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的影響及分子機(jī)制
　　方法：
　　第一部分：大鼠腦死亡模型制作方法的改進(jìn)：在傳統(tǒng)漸進(jìn)式誘導(dǎo)腦死亡模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，采用緩慢間歇顱內(nèi)加壓法，誘導(dǎo)腦死亡的發(fā)生。通過(guò)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腦死亡的判定：深昏迷、腦干反射消失

5、、自主呼吸停止及腦電圖出現(xiàn)平直。在誘導(dǎo)腦死亡發(fā)生及維持腦死亡狀態(tài)時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)顱內(nèi)壓、腦電圖、心電圖、平均動(dòng)脈壓、體溫等的變化。
　　第二部分：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)腦死亡狀態(tài)下肝損傷的機(jī)制研究：在改良的大鼠腦死亡模型的基礎(chǔ)上，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組及腦死亡組。通過(guò)免疫組織化學(xué)及蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)假手術(shù)組及腦死亡組大鼠肝臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子標(biāo)志物（Grp78和Xbp-1）及凋亡相關(guān)蛋白(Chop和Caspase-12)的變化。另外，利用原位細(xì)胞

6、凋亡法檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡及透射電鏡觀察肝細(xì)胞的微觀變化。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)基因的 mRNA表達(dá)變化。
　　第三部分：Salubrinal對(duì)大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的作用：將SD大鼠隨機(jī)分為3組：腦死亡組；腦死亡加DMSO組;腦死亡加Salubrinal組。腦死亡加DMSO組在誘導(dǎo)腦死亡前1小時(shí)腹腔注射DMSO;腦死亡加Salubrinal組在誘導(dǎo)腦死亡前1小時(shí)腹腔注射Salubrinal。qPCR檢測(cè)大鼠肝臟中C

7、hop及Caspase-12 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)大鼠肝臟中PERK、p-eIF2α、eIF2α、Chop及 Caspase-12蛋白的表達(dá)；免疫組化檢測(cè)Chop及Caspase-12在大鼠肝組織中分布和表達(dá)；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT及AST的表達(dá)；TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)果：
　　第一：建立了穩(wěn)定的大鼠腦死亡模型：經(jīng)有效的呼吸循環(huán)支持均能成功誘導(dǎo)腦死亡的發(fā)生并且均能維持腦死亡狀態(tài)6小

8、時(shí)以上，平均動(dòng)脈壓在80mmHg以上；
　　第二：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能介導(dǎo)大鼠腦死亡狀態(tài)下的肝細(xì)胞損傷：腦死亡可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物Grp78和Xbp-1表達(dá)增加，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡蛋白Chop和Caspase-12表達(dá)增加。另外，通過(guò)透射電鏡發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征以及通過(guò)原位細(xì)胞凋亡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡增加；
　　第三：Salubrinal減輕大鼠腦死亡狀態(tài)下的肝損傷：腦死亡組及 DMSO加腦死亡組在Chop及C

9、aspase-12的mRNA及蛋白表達(dá)水平以及PERK、eIF2α及p-eIF2α的蛋白表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Salubrinal干預(yù)后相對(duì)腦死亡組 p-eIF2α表達(dá)升高，eIF2α表達(dá)沒(méi)有明顯改變而P-PERK在腦死亡2h及6h表達(dá)降低。qPCR結(jié)果顯示：Salubrinal干預(yù)后Chop的mRNA表達(dá)在腦死亡4h明顯降低，Caspase-12的mRNA表達(dá)也明顯降低。我們也通過(guò)Western blot及免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：Salu

10、brinal干預(yù)后Chop及Caspase-12的蛋白表達(dá)也明顯下降。此外，Salubrinal干預(yù)后，肝功得到改善，肝細(xì)胞的凋亡減輕。
　　結(jié)論：
　　經(jīng)改良的緩慢間歇顱內(nèi)加壓法建立的大鼠腦死亡模型，較傳統(tǒng)的腦死亡模型相比具有維持腦死亡狀態(tài)時(shí)間長(zhǎng)、簡(jiǎn)單易復(fù)制、易于標(biāo)準(zhǔn)化、與臨床腦死亡相似的特點(diǎn)。
　　首次發(fā)現(xiàn)大鼠腦死亡狀態(tài)下啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的凋亡途徑介導(dǎo)腦死亡下的肝損傷。
　　首次發(fā)現(xiàn) Salub