以β-淀粉樣蛋白為靶的單價及二價真核表達載體的構(gòu)建和表達.pdf

1、該室構(gòu)建了pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-A β<,42×2>真核表達質(zhì)粒,為進一步研究Aβ<,42>主動免疫清除老年斑的作用機理和DNA疫苗的研制奠定基礎.一、Tg2576轉(zhuǎn)基因鼠基因組DNA的提取和目的基因擴增.飽和酚/氯仿法鼠尾提取Tg2576轉(zhuǎn)基因鼠基因組DNA,根據(jù)其基因序列,設計出擴增編碼Aβ基因的引物,以基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增目的基因片段Aβ<,1-42>、Aβ<,42-1>、Aβ<,42-

2、2>.二、真核表達載體pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-Aβ<,42×2>的構(gòu)建及鑒定.將目的基因片段Aβ<,1-42>純化后與質(zhì)粒pcDNA3.1分別用限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ酶切、純化后用T<,4>DNA連接酶將目的基因片段定向克隆至質(zhì)粒pcDNA3.1的多克隆位點間,得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-A β<,1-42>,將目的基因片段Aβ<,42-1>純化后與質(zhì)粒pcDNA3.1分別用兩種限制性內(nèi)切酶

3、Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ酶切、純化后用T<,4>DNA連接酶將目的基因片段Aβ<,42-1>定向克隆至質(zhì)粒pcDNA3.1的多克隆位點間.三、peDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-A β<,42×2>的真核表達.無菌提取質(zhì)粒pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-Aβ<,42×2>,用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染COS-7細胞,對其表達的蛋白進行Western Blotting鑒定,并對細胞進

4、行免疫組化染色,證實其能在真核細胞中表達出目的蛋白.綜上所述,該研究成功地擴增了目的基因片段Aβ<,1-42>、Aβ<,42-1>、Aβ<,42-2>,并將Aβ<,1-42>、Aβ<,42×2>基因分別克隆到真核表達載體上,成功地構(gòu)建單價及二價真核表達載體pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-Aβ<,42×2>.將構(gòu)建的真核表達載體轉(zhuǎn)染COS-7細胞,證實了其可在真核細胞中表達,為我們下一步將其應用于轉(zhuǎn)基因鼠奠定了基礎