BMP2和EGFP重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞的研究.pdf

1、目的:1.本實驗為建立一套行之有效的體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的方法。2.通過腺病毒介導人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(hBMP-2)和EGFP基因轉(zhuǎn)染兔BMSCs后，通過行Westenblot及免疫細胞化學染色以觀察BMP2和EGFP的表達情況。
　　方法:1.用骨穿針抽取兔股骨粗隆處的骨髓，通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁法，分離、培養(yǎng)兔BMSCs并觀察細胞生長情況。2.使用成骨誘導培養(yǎng)基（含地塞米松10-8mol/L、維生素C5

2、0mg/L、β-磷酸甘油10mmol/L、體積分數(shù)為15％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液），在誘導后第7天、14天分別檢測Ⅰ型膠原及堿性磷酸酶(ALP)，成骨誘導后第3周行鈣結(jié)節(jié)檢測;流式細胞儀檢測細胞周期和表面標記。3.轉(zhuǎn)染后，通過免疫細胞化學染色及蛋白印跡檢測外源基因的表達。
　　結(jié)果:1.分離出大量具有活性的兔BMSCs。接種48小時后觀察，細胞貼壁形態(tài)均表現(xiàn)為長梭形，呈渦旋狀、放射狀排列。一般4～5d左右可長滿培養(yǎng)瓶底壁。2

3、.兔BMSCs細胞周期約有56.84％處于G1期;CD44表達陽性，CD45表達陰性;經(jīng)成骨細胞誘導后，Ⅰ型膠原免疫組化染色顯示誘導組細胞胞質(zhì)呈陽性表達表現(xiàn)為棕黃色，正常組胞質(zhì)陰性表達。ALP酶標法顯示誘導組呈陽性表達，其含量較正常組明顯增加。實驗組誘導組茜素紅染色呈陽性，正常組未染色。3.轉(zhuǎn)染48h后，通過免疫組化檢測結(jié)果示兔BMSCs細胞胞漿可見棕黃色染色，呈陽性表達，而未轉(zhuǎn)染細胞呈陰性。分別提取轉(zhuǎn)染48h后及未轉(zhuǎn)染的細胞蛋白，We