亞低溫對(duì)腦外傷后自噬表達(dá)的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、顱腦外傷的致死致殘率非常高，除機(jī)械打擊引起的原發(fā)性損傷外，繼發(fā)性損傷引起的遲發(fā)性腦損傷和細(xì)胞死亡，包括凋亡和自噬性細(xì)胞死亡亦為顱腦損傷高致死致殘率的重要病理基礎(chǔ)。顱腦外傷后細(xì)胞凋亡通路及發(fā)生過程已較為清楚。但自噬在顱腦外傷中的作用還不甚明確。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明亞低溫具有腦保護(hù)作用，能夠減輕顱腦損傷后腦組織的病理損傷程度，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)，但是其保護(hù)機(jī)制，尤其是自噬在其中的作用仍未完全闡明。本課題采用大鼠液壓沖

2、擊腦損傷常溫及亞低溫模型探明顱腦外傷之后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和自噬的變化規(guī)律，以及亞低溫對(duì)此類遲發(fā)性細(xì)胞損傷的影響，試圖從不同的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式及其相互作用方面探討亞低溫對(duì)腦外傷繼發(fā)性病理損害的保護(hù)機(jī)制。
　　本研究共分為三個(gè)部分。第一部分:大鼠液壓沖擊顱腦損傷常溫及亞低溫模型的建立和評(píng)價(jià);第二部分:亞低溫對(duì)腦外傷后大腦皮層和海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白的影響;第三部分:調(diào)控亞低溫后自噬的表達(dá)對(duì)顱腦損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)和記憶功能的影響。

3、
　　第一部分大鼠液壓沖擊顱腦損傷常溫及亞低溫模型的建立和評(píng)價(jià)
　　目的:建立穩(wěn)定可重復(fù)的大鼠液壓沖擊顱腦損傷常溫及亞低溫模型，從組織病理學(xué)及神經(jīng)行為學(xué)，包括運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能兩方面對(duì)模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，為深入開展創(chuàng)傷性顱腦外傷的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為假損傷常溫組（18只），假損傷亞低溫組（18只），腦損傷常溫組（18只），腦損傷亞低溫組（18只）。顱腦損傷使用顱腦液壓打擊儀完成;亞低

4、溫(32.5±0.5℃)使用冰浴降溫完成，亞低溫結(jié)束后1小時(shí)內(nèi)緩慢復(fù)溫至37±0.3℃。假損傷常溫組大鼠僅做致傷準(zhǔn)備而不進(jìn)行打擊及亞低溫處理（體溫保持在37±0.3℃）;假損傷亞低溫組大鼠致傷后給予亞低溫處理;損傷常溫組大鼠僅致傷不降溫（體溫保持在37±0.3℃）;損傷亞低溫組大鼠致傷及亞低溫處理。所有試驗(yàn)動(dòng)物在損傷前后均監(jiān)測(cè)生理參數(shù)及神經(jīng)反射功能。每組各3只分別于致傷后6h及24h處死后觀察大體形態(tài)及病理改變（H&E染色）。另外各組各

5、取6只大鼠分別通過行走實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)運(yùn)動(dòng)功能及認(rèn)知功能改變。
　　結(jié)果:除腦溫及肛溫在亞低溫組有明顯差異外，所有生理參數(shù)均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)且各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。大體觀可見假損傷組及假損傷亞低溫組未見明顯大腦皮層異常改變，而在損傷常溫組及亞低溫組均可以看到明顯大腦皮層異常改變，但在亞低溫組大腦皮層損傷程度較輕;HE染色可見顯示亞低溫組大鼠致傷灶周圍皮層和海馬損傷程度較常溫組大鼠為輕。行為學(xué)檢測(cè)顯示亞低溫能夠明顯改善大鼠的運(yùn)

6、動(dòng)功能和認(rèn)知功能。
　　結(jié)論:該部分實(shí)驗(yàn)成功建立了組織病理學(xué)及神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)接近臨床中度顱腦損傷的動(dòng)物模型，為我們下一步研究亞低溫的腦保護(hù)作用提供了良好條件。
　　第二部分亞低溫對(duì)腦外傷后大腦皮層及海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白的影響
　　目的:探討中度液壓顱腦外傷及亞低溫干預(yù)對(duì)大腦皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡及自噬的變化。
　　方法:采用前期成功制作的大鼠液壓沖擊傷常溫及亞低溫模型，108只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字

7、法隨機(jī)分三組:假損傷常溫組，腦損傷常溫組，腦損傷亞低溫組。在致傷后6h和24h處死大鼠。運(yùn)用TUNEL染色分析大腦皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡指數(shù)的變化，同時(shí)使用免疫熒光技術(shù)和Western-blot技術(shù)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3及自噬相關(guān)蛋白，包括LC-3及Beclin-1進(jìn)行測(cè)定，并使用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)對(duì)自噬的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞定位，同時(shí)使用電鏡對(duì)自噬體的數(shù)量進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果:假損傷常溫組大鼠未見明顯神經(jīng)元凋亡及自噬性改

8、變。致傷后6h及24h TUNEL結(jié)果顯示液壓顱腦損傷能夠引起損傷大腦皮層及海馬CA1區(qū)明顯的細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，而亞低溫能夠抑制細(xì)胞凋亡;使用Western-blot技術(shù)檢測(cè)損傷大腦皮層及海馬CA1區(qū)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3，結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白caspase-3在腦外傷之后明顯上調(diào)，而亞低溫能夠抑制其上調(diào);使用免疫熒光技術(shù)及Western-blot技術(shù)檢測(cè)損傷大腦皮層及海馬CA1區(qū)自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1，結(jié)果顯示L

9、C3及Beclin-1在外傷后明顯上調(diào)，而亞低溫之后此種上調(diào)趨勢(shì)更加明顯;電鏡顯示自噬體的數(shù)目在顱腦外傷之后明顯增加，而亞低溫之后增加更為明顯。細(xì)胞定位顯示自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)。
　　結(jié)論:大鼠中度液壓損傷后損傷周圍區(qū)域皮層及海馬CA1區(qū)凋亡增加，自噬亦同時(shí)增加;亞低溫干預(yù)能夠明顯減少皮層及海馬區(qū)域內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時(shí)能夠增加自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　第三部分調(diào)控亞低溫后自噬的

10、表達(dá)對(duì)顱腦損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)和記憶功能的影響
　　目的:研究大鼠腦室內(nèi)注射自噬抑制劑3-MA對(duì)亞低溫干預(yù)后的損傷大腦皮層及海馬CA1區(qū)自噬及凋亡的影響以及神經(jīng)功能變化情況。
　　方法:建立大鼠腦外傷亞低溫模型，63只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為三組:腦外傷亞低溫組，腦外傷亞低溫組+腦室內(nèi)注射人工腦脊液組，腦外傷亞低溫組+腦室內(nèi)注射3-MA組。使用免疫熒光技術(shù)及Western-blot技術(shù)觀察caspase-3，LC3，Beclin-1

11、，Bcl-2及Bax的蛋白表達(dá)變化;使用電鏡觀察自噬體數(shù)目的變化;使用行走實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)變化。
　　結(jié)果:使用免疫熒光及Western-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)致傷前腦室內(nèi)注射3-MA能夠使損傷大腦皮層及海馬CA1區(qū)LC3，Beclin-1及Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低而Bax蛋白表達(dá)水平則明顯升高;Beclin-1/Bcl-2比值則明顯降低，Bcl-2/Bax比值則降低;電鏡顯示自噬體數(shù)目明顯降低;水迷宮及行走實(shí)驗(yàn)提示