Raf激酶抑制蛋白抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分
　　目的：
　　觀察Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)對(duì)卵巢癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.將含正義(Sense，())或反義(Antisense，As)RKIP cDNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人卵巢癌SKOV3細(xì)胞系，G418篩選陽性克隆，利用Western Blot進(jìn)行鑒定，選取陽性克隆。
　　2.應(yīng)

2、用Western Blot技術(shù)觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Fibronectin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響。
　　3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Fibronectin和Vimentin mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.篩選出穩(wěn)定表達(dá)重組pcDNA3.1(+)-ss RKIP和pcDNA3.1(-)-as RKIP的SKOV-

3、3細(xì)胞。
　　2.Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Fibronectin和Vimentin的蛋白表達(dá)均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞；As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Fibronectin和Vimentin的蛋白表達(dá)均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。
　　3.Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Fibronectin和Vi

4、mentin的mRNA表達(dá)均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞；As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Fibronectin和Vimentin的mRNA表達(dá)均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　RKIP可抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，其機(jī)制可能與上下調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Fibronectin和Vimentin表達(dá)有關(guān)。

5、r>　　第二部分
　　目的：
　　觀察Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)對(duì)卵巢癌細(xì)胞血管擬態(tài)的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用Matrigel三維培養(yǎng)模型觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞管道化塑形能力的影響。
　　2.應(yīng)用Western Blot技術(shù)觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/9、VE-

6、cadherin和EphA2蛋白表達(dá)的影響。
　　3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2 mRNA表達(dá)的影響。
　　4.應(yīng)用明膠酶譜分析法，觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/9活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在三維培養(yǎng)條件下，Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)的能力明顯低于空載體pcDNA

7、3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞；As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)的能力明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。
　　2.Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的蛋白表達(dá)均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞；As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的蛋白表達(dá)均明顯高于空載體pcDNA

8、3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。
　　3.Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的mRNA表達(dá)均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞；As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的mRNA表達(dá)均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。
　　4.Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2/9的活

9、性均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞；As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2/9的活性明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　RKIP可抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞血管擬態(tài)的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2表達(dá)和活性有關(guān)。
　　第三部分
　　目的：
　　觀察Raf激酶抑制蛋白(Raf

10、 kinase inhibitor protein，RKIP)對(duì)卵巢癌細(xì)胞中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變和血管生成調(diào)控因子影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用ELISA技術(shù)觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表達(dá)的影響。
　　2.應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-к B和AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　結(jié)果：

11、r>　　1.Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表達(dá)均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞；As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表達(dá)均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。
　　2.Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-к B和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和

12、未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞；As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-к B和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　RKIP可抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變和血管生成調(diào)控因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8的表達(dá)，其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-к B和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。
　　第四部分
　　目的：
　　觀察Raf激酶抑

13、制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)對(duì)人卵巢癌SKOV-3腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型裸鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.建立裸鼠人卵巢癌SKOV-3腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察RKIP對(duì)SKOV-3體內(nèi)成瘤能力和腹腔轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　2.應(yīng)用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV-3腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型小鼠卵巢侵襲的影響。
　　3.應(yīng)用免疫

14、組化的方法觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV-3腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型小鼠Vimentin、Fibronectin、E-cadherin、CD44、ICAM-1、MMP-2、MMP-9、p65(NF-кB)和c-Jun(AP-1)表達(dá)的影響。
　　4.應(yīng)用ELISA技術(shù)觀察RKIP對(duì)人卵巢癌SKOV-3腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型小鼠血清中細(xì)胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.裸鼠人卵巢癌SKOV-3

15、腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型中，Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力和腹腔轉(zhuǎn)移能力明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞；As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力和腹腔轉(zhuǎn)移能力明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞。
　　2.裸鼠人卵巢癌SKOV-3腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型中，Ss RKIP轉(zhuǎn)染組在活體成像中的熒光強(qiáng)度明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組；As RKIP轉(zhuǎn)染組在

16、活體成像中的熒光強(qiáng)度明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組，反映了Ss RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的體內(nèi)侵襲能力低于As RKIP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　RKIP可抑制人卵巢癌SKOV-3腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型裸鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力，其機(jī)制可能與上調(diào)蛋白E-cadherin表達(dá)，下調(diào)蛋白Vimentin、Fibronectin、CD44、ICAM-1、MMP-2、MMP-9、p65(NF-кB)和c-Jun(AP