Raf激酶抑制蛋白抑制卵巢癌轉移分子機制的研究.pdf

1、第一部分
　　目的：
　　觀察Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)對卵巢癌細胞上皮-間充質轉變的影響，并初步探討其可能的作用機制。
　　方法：
　　1.將含正義(Sense，())或反義(Antisense，As)RKIP cDNA的表達載體轉染人卵巢癌SKOV3細胞系，G418篩選陽性克隆，利用Western Blot進行鑒定，選取陽性克隆。
　　2.應

2、用Western Blot技術觀察RKIP對人卵巢癌SKOV3細胞中間充質細胞標志蛋白Fibronectin和Vimentin蛋白表達的影響。
　　3.應用實時熒光定量PCR觀察RKIP對人卵巢癌SKOV3細胞中間充質細胞標志蛋白Fibronectin和Vimentin mRNA表達的影響。
　　結果：
　　1.篩選出穩(wěn)定表達重組pcDNA3.1(+)-ss RKIP和pcDNA3.1(-)-as RKIP的SKOV-

3、3細胞。
　　2.Ss RKIP轉染組細胞的間充質細胞標志蛋白Fibronectin和Vimentin的蛋白表達均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞；As RKIP轉染組細胞的間充質細胞標志蛋白Fibronectin和Vimentin的蛋白表達均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞。
　　3.Ss RKIP轉染組細胞的間充質細胞標志蛋白Fibronectin和Vi

4、mentin的mRNA表達均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞；As RKIP轉染組細胞的間充質細胞標志蛋白Fibronectin和Vimentin的mRNA表達均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞。
　　結論：
　　RKIP可抑制卵巢癌SKOV-3細胞的上皮-間充質轉變，其機制可能與上下調間充質細胞標志蛋白Fibronectin和Vimentin表達有關。

5、r>　　第二部分
　　目的：
　　觀察Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)對卵巢癌細胞血管擬態(tài)的影響，并初步探討其可能的作用機制。
　　方法：
　　1.應用Matrigel三維培養(yǎng)模型觀察RKIP對人卵巢癌SKOV3細胞管道化塑形能力的影響。
　　2.應用Western Blot技術觀察RKIP對人卵巢癌SKOV3細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2/9、VE-

6、cadherin和EphA2蛋白表達的影響。
　　3.應用實時熒光定量PCR觀察RKIP對人卵巢癌SKOV3細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2 mRNA表達的影響。
　　4.應用明膠酶譜分析法，觀察RKIP對人卵巢癌SKOV3細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2/9活性的影響。
　　結果：
　　1.在三維培養(yǎng)條件下，Ss RKIP轉染組細胞形成管腔樣結構的能力明顯低于空載體pcDNA

7、3.1(+)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞；As RKIP轉染組細胞形成管腔樣結構的能力明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞。
　　2.Ss RKIP轉染組細胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的蛋白表達均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞；As RKIP轉染組細胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的蛋白表達均明顯高于空載體pcDNA

8、3.1(-)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞。
　　3.Ss RKIP轉染組細胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的mRNA表達均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞；As RKIP轉染組細胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2的mRNA表達均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞。
　　4.Ss RKIP轉染組細胞中MMP-2/9的活

9、性均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞；As RKIP轉染組細胞中MMP-2/9的活性明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞。
　　結論：
　　RKIP可抑制卵巢癌SKOV-3細胞血管擬態(tài)的發(fā)生發(fā)展，其機制可能與下調細胞中MMP-2/9、VE-cadherin和EphA2表達和活性有關。
　　第三部分
　　目的：
　　觀察Raf激酶抑制蛋白(Raf

10、 kinase inhibitor protein，RKIP)對卵巢癌細胞中上皮-間充質轉變和血管生成調控因子影響，并初步探討其可能的作用機制。
　　方法：
　　1.應用ELISA技術觀察RKIP對人卵巢癌SKOV3細胞的細胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表達的影響。
　　2.應用熒光素酶報告基因技術觀察RKIP對人卵巢癌SKOV3細胞中轉錄因子NF-к B和AP-1轉錄活性的影響。
　　結果：

11、r>　　1.Ss RKIP轉染組細胞的細胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表達均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞；As RKIP轉染組細胞的細胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表達均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞。
　　2.Ss RKIP轉染組細胞中轉錄因子NF-к B和AP-1的轉錄活性均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉染組細胞和

12、未轉染的對照組細胞；As RKIP轉染組細胞中轉錄因子NF-к B和AP-1的轉錄活性均明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞。
　　結論：
　　RKIP可抑制卵巢癌SKOV-3細胞中上皮-間充質轉變和血管生成調控因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8的表達，其機制可能與下調細胞中轉錄因子NF-к B和AP-1的轉錄活性有關。
　　第四部分
　　目的：
　　觀察Raf激酶抑

13、制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)對人卵巢癌SKOV-3腹腔轉移瘤模型裸鼠體內(nèi)腫瘤轉移侵襲能力的影響，并初步探討其可能的作用機制。
　　方法：
　　1.建立裸鼠人卵巢癌SKOV-3腹腔轉移瘤模型，觀察RKIP對SKOV-3體內(nèi)成瘤能力和腹腔轉移能力的影響。
　　2.應用小動物活體成像系統(tǒng)觀察RKIP對人卵巢癌SKOV-3腹腔轉移瘤模型小鼠卵巢侵襲的影響。
　　3.應用免疫

14、組化的方法觀察RKIP對人卵巢癌SKOV-3腹腔轉移瘤模型小鼠Vimentin、Fibronectin、E-cadherin、CD44、ICAM-1、MMP-2、MMP-9、p65(NF-кB)和c-Jun(AP-1)表達的影響。
　　4.應用ELISA技術觀察RKIP對人卵巢癌SKOV-3腹腔轉移瘤模型小鼠血清中細胞因子VEGF、bFGF、TGF-β和IL-8表達的影響。
　　結果：
　　1.裸鼠人卵巢癌SKOV-3

15、腹腔轉移瘤模型中，Ss RKIP轉染組細胞的體內(nèi)成瘤能力和腹腔轉移能力明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞；As RKIP轉染組細胞的體內(nèi)成瘤能力和腹腔轉移能力明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉染組細胞和未轉染的對照組細胞。
　　2.裸鼠人卵巢癌SKOV-3腹腔轉移瘤模型中，Ss RKIP轉染組在活體成像中的熒光強度明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉染組和未轉染的對照組；As RKIP轉染組在

16、活體成像中的熒光強度明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉染組和未轉染的對照組，反映了Ss RKIP轉染組細胞的體內(nèi)侵襲能力低于As RKIP轉染組細胞。
　　結論：
　　RKIP可抑制人卵巢癌SKOV-3腹腔轉移瘤模型裸鼠體內(nèi)腫瘤轉移侵襲能力，其機制可能與上調蛋白E-cadherin表達，下調蛋白Vimentin、Fibronectin、CD44、ICAM-1、MMP-2、MMP-9、p65(NF-кB)和c-Jun(AP