骨形成蛋白-7干預(yù)對肝纖維化EGFR表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的:肝纖維化是持續(xù)性慢性肝臟損傷引起的一種復(fù)雜的組織修復(fù)反應(yīng)，缺乏有效的控制將會導(dǎo)致門脈高壓、肝硬化，甚至于最終進(jìn)展為肝細(xì)胞癌。全世界肝硬化的負(fù)擔(dān)仍然引人注目，數(shù)億人患有慢性肝臟疾病。越來越多的證據(jù)表明慢性肝臟疾病患者經(jīng)過有效治療肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。盡管如此尚沒有有效的抗纖維化藥物，因此，肝纖維化的內(nèi)在機(jī)制還有待闡明。靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞激活成為具有肌成纖維細(xì)胞樣表型和異常細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積累被認(rèn)為是肝纖維化的發(fā)病機(jī)制的關(guān)

2、鍵事件。很多研究表明轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在過度的組織重塑過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，能促進(jìn)成纖維細(xì)胞募集、肌成纖維細(xì)胞分化、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。骨形成蛋白-7（BMP-7）和轉(zhuǎn)化生長因子β同屬于TGFβ超家族，研究表明BMP-7能夠負(fù)性調(diào)控TGF-β1活性。然而，BMP-7對肝纖維化的作用及其機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)通過觀察肝纖維化小鼠模型中表皮生長因子受體(EGFR)的動態(tài)表達(dá)，以及骨形成蛋白-7干預(yù)對其表達(dá)的影響

3、，探討治療纖維化的新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.肝纖維化小鼠模型的建立及指標(biāo)檢測60只健康雄性ICR小鼠，體重18g-25g，隨機(jī)分為正常對照組（6只）、模型組（38只）和干預(yù)組（16只）。預(yù)留30只小鼠用于觀察生存率。將四氯化碳溶于甘油中配成40％的四氯化碳溶液，按0.5mL/100 g體重皮下注射，每周兩次，注射12周制備肝纖維化模型，模型組小鼠分別在造模后4周、8周、12周隨機(jī)取10只小鼠處死。干預(yù)組小鼠在造模后第8周

4、開始腹腔注射人重組BMP-7（300 pg/g體重），隔天一次，持續(xù)4周后處死。正常對照組予常規(guī)喂養(yǎng)至12周，觀察生存率后全部處死。所有處死小鼠均留取血清及肝組織標(biāo)本，采用HE和Manson染色觀察肝組織病理變化，并進(jìn)行肝纖維化半定量評分;下腔靜脈采血檢測ALT、AST和Alb;采用PCR檢測各組肝臟TGF-β1和α-SMAmRNA水平，采用Western印跡法檢測各組肝臟TGF-β1、α-SMA、EGFR和pEGFR蛋白表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)

5、學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)及指標(biāo)檢測復(fù)蘇凍存的肝星狀細(xì)胞系HSC-T6，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的高糖DMEM，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24小時(shí)換液，待細(xì)胞生長至80％-90％融合時(shí)按1∶3傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至第三代時(shí)接種于六孔板中，接種密度為1.8×105/ml，實(shí)驗(yàn)分為對照組、TGF-β15ng/ml組、TGF-β15ng/m

6、l+BMP-7500ng/ml組、TGF-β15ng/ml+BMP-71000ng/ml組、TGF-β15ng/ml+BMP-72000ng/ml組及BMP-72000ng/ml組，共6組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)48小時(shí)后提取各組RNA及蛋白。采用PCR檢測各組細(xì)胞TGF-β1、α-SMA和EGFRmRNA水平，采用Western印跡法檢測各組細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、EGFR和pEGFR蛋白表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0

7、對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立小鼠肝纖維化模型:正常對照組、模型組及BMP-7干預(yù)組小鼠生存率分別為100％、70％、90％。病理結(jié)果顯示正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤，門脈區(qū)成纖維細(xì)胞增生活躍，形成多數(shù)典型的假小葉;BMP-7干預(yù)組與模型組12周相比，炎性細(xì)胞浸潤減輕，纖維增生明顯減輕，但仍可以見到少量完整假小葉形成。血生化結(jié)果顯示肝纖維化模型組血清ALT、

8、AST均逐漸升高，在12周達(dá)到高峰(ALT191.3±24.5，AST206.6±25.0)，與正常對照組(ALT39.2±4.7，AST41.9±5.3)相比明顯升高。Alb逐漸降低，于12周達(dá)到最低值(Alb22.2±1.2)，與正常對照組(34.3±3.2)相比明顯降低。BMP-7干預(yù)組(ALT153.9±18.1，AST177.8±19.2，Alb25.4±0.9)各指標(biāo)與模型組12周相比均有所緩解（均P＜0.05）。
　

9、　2.RT-PCR結(jié)果:模型組隨著纖維化的進(jìn)展，TGF-β1及α-SMA的mRNA表達(dá)量均逐漸增高，于12周時(shí)達(dá)到高峰（TGF-β1及α-SMA/β-actin吸光度比值分別為1.265598±0.1164554，1.399128±0.0128198），BMP-7干預(yù)后（TGF-β1及α-SMA/β-actin吸光度比值分別為0.852859±0.0271796，0.976972±0.0569936)，上述兩種mRNA水平均明顯降低（均

10、P＜0.05）。
　　3.Western印跡結(jié)果:模型組隨著纖維化的進(jìn)展，TGF-β1、α-SMA、EGFR及pEGFR的蛋白表達(dá)量均逐漸增高，于12周時(shí)達(dá)到高峰（TGF-β1、α-SMA、EGFR及pEGFR/β-actin吸光度比值分別為0.286596±0.0143275，1.321050±0.0067735,1.093709±0.0146172,1.007172±0.0627513),BMP-7干預(yù)后（TGF-β1、α-S

11、MA、EGFR及pEGFR/β-actin吸光度比值分別為0.220590±0.0113319,1.110704±0.0017764,0.738560±0.0660173,0.398902±0.0711029)，上述三種蛋白的表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05）。直線相關(guān)分析顯示，TGF-β1與EGFR/pEGFR表達(dá)量均呈正相關(guān)(rs=0.895、0.859，均P＜0.05)。
　　4.通過TGF-β1與BMP-7干預(yù)肝星狀細(xì)胞

12、系HSC-T6的研究，于體外水平驗(yàn)證了BMP-7對抗肝纖維化的作用。正常對照組TGF-β1、α-SMA的mRNA與蛋白表達(dá)水平均較低，TGF-β1干預(yù)后，二者表達(dá)量與正常組相比均明顯升高(P＜0.05)。而當(dāng)培養(yǎng)體系中增加BMP-7后，TGF-β1及α-SMA表達(dá)量均有所降低，且隨著BMP-7濃度的增加，降低趨勢更加明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.05)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在加入TGF-β1后EGFR及pEGFR的蛋白表達(dá)量較對照組升高