蛇根木異胡豆苷糖苷酶及Vinorine合成酶表達(dá)、純化、抑制劑抑制機(jī)理和復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、蛇根木(Rauvolfia serpentina Benth.ex Kurz)為夾竹桃科蘿芙木屬藥用植物，其藥用部位根含有90余種生物堿，主要活性成分包括阿嗎靈、阿嗎堿、利血平、瑞西那明和地舍平，有抗心律失常、降血壓、鎮(zhèn)靜和止痛等作用。研究該次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑是我們準(zhǔn)確了解生物合成機(jī)理以及調(diào)控代謝方向、體外異源表達(dá)活性成分和酶修飾等的前提。本論文對(duì)參與阿嗎靈生物合成途徑中重要的異胡豆苷糖苷酶(Strictosidine-O-bet

2、a-D-glucosidase，SG)和Vinorine合成酶(VinorineSynthase，VS)進(jìn)行了系列研究，主要包括酶表達(dá)、純化、復(fù)合物結(jié)晶、三維結(jié)構(gòu)表征及抑制劑抑制機(jī)理等研究。
　　 課題組在前期對(duì)異胡豆苷糖苷酶的生物化學(xué)以及單晶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，通過(guò)序列比對(duì)和相關(guān)驗(yàn)證得出其為糖苷水解酶家族成員(Glycoside hydrolase，GH)。發(fā)現(xiàn)及合成潛在糖苷酶抑制劑具有重要的意義，如在人體糖尿病治療，溶酶體

3、存儲(chǔ)紊亂或是病毒感染以及抑制這些糖苷酶會(huì)對(duì)代謝等產(chǎn)生重要影響。
　　 本文第一部分對(duì)近年來(lái)引起廣泛興趣的糖苷酶抑制劑進(jìn)行了基于酶三維結(jié)構(gòu)和原子水平上的抑制機(jī)理分析與闡釋。摸索相關(guān)糖苷酶與不同抑制劑復(fù)合物的結(jié)晶條件，采用氣相擴(kuò)散懸滴法進(jìn)行結(jié)晶，底物浸泡法獲取酶與抑制劑的復(fù)合物，對(duì)所搜集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，獲得酶與抑制劑的三維結(jié)構(gòu)，闡明不同抑制劑的抑制機(jī)理。為進(jìn)一步抑制劑的設(shè)計(jì)與化學(xué)合成提供結(jié)構(gòu)上的重要信息，同時(shí)，也能為酶結(jié)構(gòu)修飾改變

4、其底物特異性提供新型高效的生物催化劑奠定理論基礎(chǔ)。
　　 VS酶是BAHD家族中第一個(gè)得到三維結(jié)構(gòu)的酶，但其結(jié)合、活性位點(diǎn)及催化機(jī)理尚不確定，因此對(duì)VS酶與其底物或輔因子等的復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)解析顯得尤為重要。本論文采用突變法及重新篩選新結(jié)晶條件等手段嘗試獲取復(fù)合物單晶，并搜集了衍射數(shù)據(jù)，經(jīng)初步處理得到了不同于先前結(jié)構(gòu)的晶胞構(gòu)型。高通量篩選發(fā)現(xiàn)了三個(gè)不同的苗頭結(jié)晶條件，是接下來(lái)優(yōu)化及獲得適合X-射線(xiàn)衍射的復(fù)合物單晶的前提條件。