二甲雙胍對非酒精性脂肪肝細胞模型脂質(zhì)沉積、PGC-1α表達和氧化應激水平的影響.pdf

1、研究目的：
　　以油酸誘導正常人肝臟細胞L-02細胞建立NAFLD細胞模型,研究NAFLD形成前后核轉(zhuǎn)錄共激活因子PGC-1α表達、脂質(zhì)及氧化應激水平的變化,在模型建立成功的基礎上添加胰島素增敏劑二甲雙胍,觀察不同濃度二甲雙胍對NAFLD細胞模型PGC-1α基因及蛋白質(zhì)的表達、氧化應激水平的影響,以及PGC-1α的表達與肝臟細胞脂肪堆積、線粒體損傷及氧化應激的關系,探討 PGC-1α在NAFLD發(fā)病過程中的作用,從而進一步闡明NA

2、FLD的發(fā)病機制及二甲雙胍用于NAFLD治療的作用機制。
　　研究方法：
　　用20μg/ml油酸(油酸以0.5％DMSO溶解)誘導正常人肝臟細胞 L-02細胞72h,建立非酒精性脂肪變性肝細胞模型。通過電鏡觀察及細胞內(nèi)甘油三酯水平的檢測鑒定模型建立成功。對照組加入含10%胎牛血清的普通1640培養(yǎng)基。在模型組中分別添加含2.5、5、7.5 mmol/l終濃度的二甲雙胍分別建立低、中、高劑量組,標記為1、2、3組,繼續(xù)培養(yǎng)2

3、4h后收集細胞。采用RT-PCR檢測L-02細胞PGC-1αmRNA的轉(zhuǎn)錄,Western blot技術檢測L-02細胞PGC-1α蛋白質(zhì)的表達,采用甘油三酯(組織細胞)酶法測定試劑盒檢測L-02細胞中甘油三脂的變化,采用硫代巴比妥酸反應法測定細胞MDA含量,采用黃嘌呤氧化物法測定細胞SOD活性。
　　結(jié)果：
　　1.電鏡下觀察
　　對照組細胞中可見少量大小不等的脂滴,線粒體呈橢圓形或圓形,嵴膜清晰。模型組細胞中脂滴明

4、顯增多(生化檢測示模型組細胞內(nèi)甘油三酯水平明顯升高,說明油酸誘導造模成功),少數(shù)線粒體出現(xiàn)空泡樣改變。二甲雙胍終濃度為2.5mmol/l(1組)、5mmol/l(2組)組細胞中可見脂滴分布,線粒體空泡樣改變有所減少。二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l(3組)組細胞中可見較少脂滴,線粒體稍腫脹,但線粒體嵴膜清晰。
　　2.細胞內(nèi)甘油三酯水平
　　與對照組相比,模型組細胞內(nèi)甘油三酯水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);

5、當二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l時,細胞內(nèi)甘油三脂明顯減少,與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l組比終濃度為2.5mmol/l組細胞內(nèi)甘油三脂明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);
　　3.細胞內(nèi)MDA濃度和SOD活力
　　與對照組相比,模型組細胞內(nèi) MDA濃度明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而SOD活力卻明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相

6、比,當二甲雙胍終濃度為5mmol/l組、7.5mmol/l時,細胞內(nèi)MDA濃度明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而SOD活力卻升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與二甲雙胍終濃度為2.5mmol/l組相比,當二甲雙胍終濃度為5mmol/l、7.5mmol/l時,細胞內(nèi)MDA濃度明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而SOD活力卻升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4.細胞PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平

7、
　　與對照組相比,模型組L-02細胞中PGC-1αmRNA表達量明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比,當二甲雙胍終濃度為2.5mmol/l、5mmol/l、7.5mmol/l時L-02細胞中PGC-1α mRNA表達量明顯增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。二甲雙胍終濃度為7.5mmol/l組比終濃度為2.5mmol/l組細胞內(nèi)PGC-1αmRNA表達量明顯增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。<

8、br>　　5.細胞PGC-1α蛋白質(zhì)表達水平
　　與對照組相比,模型組L-02細胞中PGC-1α蛋白質(zhì)表達量明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比,當二甲雙胍終濃度為5mmol/l、7.5mmol/l時L-02細胞中PGC-1α蛋白質(zhì)表達水平明顯增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　6.相關性
　　肝細胞中PGC-1α表達水平與甘油三酯、MDA及SOD的相關性:L-02細胞中 PGC-1α

9、 mRNA、蛋白質(zhì)的表達水平與細胞內(nèi)甘油三酯的水平呈負相關(r=-0.581、-0.601,P<0.05);PGC-1αmRNA、蛋白質(zhì)的表達水平與細胞內(nèi)MDA的水平呈負相關(r=-0.629、-0.571,P<0.05);PGC-1αmRNA、蛋白質(zhì)的表達水平與細胞內(nèi)SOD的水平呈相關(r=0.746、0.574,P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、用20μg/ml油酸誘導L-02細胞可成功構建NAFLD細胞模型。