瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Fas及P53蛋白凋亡缺陷的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景及目的： 對(duì)于瘢痕疙瘩來說，目前尚無有效的治療手段，其綜合治療的效果也不理想，存在較高的復(fù)發(fā)率。一般認(rèn)為瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞屬于非正常細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞類似，雖然組織內(nèi)存在大量凋亡的細(xì)胞，但是瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞為多克隆來源，體內(nèi)存在不同表型的成纖維細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后細(xì)胞變成單一表型，而且這種細(xì)胞不易凋亡。尋找瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡缺陷機(jī)制及有效誘導(dǎo)其凋亡的方法對(duì)瘢痕疙瘩治療有重要意義。 基于以上觀點(diǎn)，課題組致力于研究

2、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡缺陷的機(jī)制，探索瘢痕疙瘩的基因治療，尋找有效的瘢痕疙瘩治療方法。通過對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞p53基因及fas基因系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)：1.瘢痕疙瘩病人血細(xì)胞中p53基因第72位密碼子Pro等位基因頻率明顯高于Arg等位基因頻率，與Arg/Arg及Arg/Pro基因型人群相比，Pro/Pro基因型人群易患瘢痕疙瘩。血細(xì)胞中p53基因第72位密碼子多態(tài)性位點(diǎn)的基因型檢測(cè)對(duì)判斷瘢痕疙瘩高危個(gè)體具有指導(dǎo)意義，并開發(fā)出了可用于普通人

3、群的p53基因第72位密碼子基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒。2.Fas單克隆抗體在ng-μg水平即可迅速誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡，而在相同濃度下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對(duì)此卻無反應(yīng)。3.增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Fas表達(dá)較低，但瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Fas卻呈高表達(dá)，兩者間差異顯著，瘢痕疙瘩細(xì)胞的凋亡異常不是由于缺乏受體所導(dǎo)致的。4.瘢痕疙瘩Fas介導(dǎo)死亡信號(hào)傳導(dǎo)阻滯，而且阻斷的位點(diǎn)位于上游。5.攜帶正常人fas基因的脂質(zhì)體及重組腺病毒均能有效地將fa

4、s基因?qū)?，并且能使目的基因在靶?xì)胞內(nèi)完整且有效的表達(dá)，瘢痕疙瘩細(xì)胞Fas通道能得以穩(wěn)定重建，且通道重建后瘢痕疙瘩細(xì)胞增殖-凋亡狀況的失衡得到了明顯的改善。 通過以上研究結(jié)果，我們對(duì)瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制與p53基因及fas基因的關(guān)系有了比較充分的了解，但是有些問題還值得我們進(jìn)一步探討。 p53基因外顯子4第72編碼子基因多態(tài)性是近年研究的熱點(diǎn)，不同的基因型與多種腫瘤發(fā)病相關(guān)，其產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞凋亡有不同的影響，局部組織基因型存在

5、相互變異的現(xiàn)象，而且Arg等位基因占優(yōu)勢(shì)的腫瘤預(yù)后明顯好于Pro等位基因占優(yōu)勢(shì)的腫瘤。瘢痕疙瘩類似良性腫瘤，患者局部組織基因多態(tài)性有無變異，不同的基因型對(duì)蛋白的表達(dá)有無影響，與臨床表型的關(guān)系如何，這些都是我們必須回答的問題。 與增生性瘢痕相比，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)強(qiáng)陽性，而經(jīng)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞FasMcAb不能有效誘導(dǎo)凋亡，分析其中的原因：其一為Fas蛋白結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致不能有效誘導(dǎo)凋亡。另外Fas蛋白是一種

6、糖蛋白，只有糖基化的蛋白才能有效表達(dá)于細(xì)胞膜上，蛋白糖基化的程度與功能存在明顯相關(guān)。因此我們采用WesternBlot法檢測(cè)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞Fas蛋白糖基化水平，PI染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成纖維細(xì)胞FasMcAb作用后的凋亡率，分析Fas蛋白糖基化水平與FasMcAb誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)性，并利用蛋白糖基化抑制劑衣霉素(Tunicamycine，TM)抑制成纖維細(xì)胞Fas蛋白糖基化，觀察成纖維細(xì)胞Fas蛋白糖基化水平變化后對(duì)凋亡的影響。

7、 目前臨床上沒有確切有效的瘢痕疙瘩治療方法，轉(zhuǎn)染野生型fas基因能有效誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡，具有廣闊的前景，但是尚不能直接用于病人，短期內(nèi)主要還是研究藥物治療為主。在各種誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，受體通路與線粒體通路是2條基本通路。缺氧可有效啟動(dòng)線粒體依賴的caspases激活途徑誘導(dǎo)凋亡，順鉑可同時(shí)啟動(dòng)Fas受體途徑及線粒體依賴的caspases激活途徑誘導(dǎo)凋亡，這在冠心病發(fā)病機(jī)制的研究中及腫瘤的治療中已進(jìn)行了廣泛的研究，但

8、在瘢痕疙瘩領(lǐng)域，無論在臨床治療或?qū)嶒?yàn)研究中，除基因轉(zhuǎn)染外，尚未見報(bào)道有效的誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的方法。因此我們利用缺氧及順鉑處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，觀察是否能有效誘導(dǎo)其凋亡。 本實(shí)驗(yàn)在課題組先前研究結(jié)果的基礎(chǔ)上再次探討凋亡基因p53及fas，以組織標(biāo)本及體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在闡明它們?cè)隈：鄹泶癫煌课怀衫w維細(xì)胞凋亡過程中扮演的角色以及功能缺陷的可能機(jī)制，并對(duì)順鉑及缺氧誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了初步探

9、討，為今后這方面的治療工作進(jìn)行了初步研究。 方法： 1.以正常人為對(duì)照，收集35例瘢痕疙瘩病人血標(biāo)本及組織標(biāo)本，瘢痕疙瘩組織標(biāo)本分中央部和周邊部。提取血標(biāo)本及組織標(biāo)本的DNA，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增p53基因外顯子4，并進(jìn)行基因測(cè)序；采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)P53蛋白的表達(dá)。 2.采用組織培養(yǎng)技術(shù)，以手術(shù)切除的瘢痕疙瘩及增生性瘢痕為組織來源的體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，WesternBlot法及流式細(xì)胞

10、術(shù)檢測(cè)衣霉素處理前后成纖維細(xì)胞Fas糖蛋白的表達(dá)及FasMcAb誘導(dǎo)凋亡率的變化。 3.順鉑及缺氧誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢測(cè)成纖維細(xì)胞凋亡率的變化，WesternBlot法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1.p53基因72位編碼子遺傳基因型有三種：CCC/CCC、CCC/CGC、CGC/CGC，其產(chǎn)物分別是Pro/Pro、Pro/Arg、Arg/Arg。瘢痕疙瘩組Pro/Pro

11、、Pro/Arg、Arg/Arg三種遺傳基因型分布與臨床表型密切相關(guān)，大體積瘢痕疙瘩患者遺傳基因型為Pro/Pro，局部瘢痕組織則存在由周邊的Pro向中央Arg變異的趨勢(shì)。瘢痕疙瘩P53蛋白表達(dá)位于胞漿中，陽性率35/35，與瘢痕疙瘩臨床表型及部位密切相關(guān)。正常皮膚無表達(dá)。 2.增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Fas蛋白糖基化水平高于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，兩組成纖維細(xì)胞FasMcAb作用后凋亡率與Fas蛋白糖基化成正相關(guān)，衣霉素可明顯降低成纖

12、維細(xì)胞Fas蛋白糖基化水平及FasMcAb作用后凋亡率。 3.缺氧條件下培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，其凋亡率及Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)無明顯變化。順鉑作用后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡率增加，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bax的表達(dá)增加。 結(jié)論： 1.瘢痕疙瘩臨床表型與p53基因外顯子4第72編碼子基因多態(tài)性密切相關(guān)，遺傳基因型為Pro/Pro患者一般表現(xiàn)為大體積、多發(fā)；瘢痕疙瘩患者局部組織基因型有Pro向Arg變異的趨勢(shì)，