過表達sortilin促進神經(jīng)生長因子前體誘導的瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡及作用機制.pdf

1、瘢痕疙瘩屬于病理性瘢痕，其特點是過度的皮膚纖維化和異常愈合的傷口瘢痕。具體發(fā)病機制尚不明確，目前尚無安全有效的治療方法。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）也稱為神經(jīng)營養(yǎng)因子，機體首先分泌合成神經(jīng)生長因子前體(proNGF)，然后由蛋白酶分解為成熟的神經(jīng)生長因子。NGF和proNGF在與高親和力酪氨酸激酶受體(TrkA)和低親和力受體(p75NTR)進行結(jié)合的基礎上來調(diào)控細胞的生死;在激活不同受體的情況下神經(jīng)生

2、長因子能夠發(fā)揮完全相反的生物作用，在與受體p75NTR結(jié)合時可以促進細胞凋亡，相反與高親和力受體TrkA結(jié)合時則可以激活NF-kB通路，從而促進細胞增殖。proNGF誘導細胞凋亡的能力明顯強于NGF，proNGF與p75的結(jié)合力明顯高于其與TrkA的結(jié)合力，proNGF是以形成proNGF-p75-sortilin配體受體復合物，激活信號傳導通路，從而誘導細胞凋亡。其中在神經(jīng)生長因子前體介導的細胞凋亡過程中Sortilin發(fā)揮了“開關(guān)作

3、用”，控制P75NTR發(fā)揮關(guān)鍵作用，在本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，瘢痕成纖維細胞中輔助受體Sortilin的表達水平較正常皮膚成纖維細胞明顯下降，其可能與瘢痕的成纖維細胞過度增殖有關(guān)，但其具體作用機制尚不清楚。
　　瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFs)過度增殖與proNGF（神經(jīng)生長因子前體）有密切關(guān)系，但具體機制尚不清楚，并且proNGF受體在瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常人皮膚成纖維細胞(NFs)中的表達是否存在差異，因此，在本研究中，我們對

4、比觀察Sortilin及p75在KFs和NFs中的表達差異，并通過基因工程技術(shù)過表達Sortilin，檢測proNGF誘導KFs-Sortilin細胞凋亡的影響并探索相關(guān)機制。
　　第一部分 Sortilin在人瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞中的表達差異
　　目的：
　　研究Sortilin在KFs和NFs中的表達差異，分析尋找瘢痕疙瘩疾病的發(fā)病機制，為瘢痕疙瘩的徹底有效治療提供理論支持。
　　方法：

5、r>　　收集正常人皮膚組織8例，瘢痕疙瘩8例，分別按照實驗設計分組培養(yǎng)KFs和NFs。采用Real-Time PCR(實時熒光定量PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot)方法檢測不同細胞中sortilin表達量的差異，同時利用流式細胞術(shù)及Caspase-3檢測分析細胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　Real-Time PCR及Western Blot檢測顯示在mRNA水平和蛋白水平上Sortilin在KFs和NFs中均

6、呈陽性表達，但是Sortilin在KFs中表達量較NFs中表達量顯著降低，p＜0.05，其差別有統(tǒng)計學意義。而p75在KFs和NFs中的表達無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：
　　Sortilin在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達明顯減少，可能與瘢痕疙瘩成纖維細胞過度增殖有關(guān)。
　　第二部分 過表達Sortilin促進proNGF誘導的瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡
　　目的：
　　研究Sortilin在神經(jīng)生長因子前體(proN

7、GF)誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡中的影響，并分析其信號轉(zhuǎn)導通路及作用機制，為臨床上對瘢痕疙瘩的干預治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　我們以KFs和NFs為研究對象。通過基因工程方法構(gòu)建過表達Sortilin質(zhì)粒，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染培育過表達Sortilin的瘢痕疙瘩成纖維細胞，然后利用流式細胞術(shù)及Caspase-3分析檢測各組細胞凋亡情況;最后通過免疫蛋白印跡分析其凋亡信號蛋白表達情況，以明確其誘導凋亡的信號轉(zhuǎn)導機制。

8、>　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建過表達Sortilin質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后成功培育篩選出過表達Sortilin的瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFs-Sortilin)的穩(wěn)定細胞株，KFs-Sortilin凋亡顯著增強，并且在有proNGF存在是KFs-Sortilin細胞凋亡更加顯著，其差異有統(tǒng)計學意義。通過免疫蛋白印跡方法分析Sortilin參與凋亡的信號轉(zhuǎn)導通路途徑，結(jié)果顯示PI3K/Akt/NF-κB信號通路蛋白表達明顯降低，Bax蛋白的表達明顯

9、增加，其差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　過表達Sortilin明顯促進proNGF誘導的細胞凋亡。誘導細胞凋亡途徑是通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路，并且Bax的表達增加。總之，我們的研究表明，通過基因工程技術(shù)過表達Sortilin后，proNGF誘導的KFs細胞凋亡顯著增強，其具體機制可能是通過增加Bax的表達，抑制PI3K/Akt激活NF-κB信號通路，總之我們通過本實驗研究成功培育出過表達Sortili