ALA-PDT通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS）途徑探究5-氨基酮戊酸（5-aminolevulnilic acid, ALA）光動(dòng)力療法（photodynamic therapy, PDT）誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblasts, KFB）凋亡的可能機(jī)制。
　　方法：1.采用組織塊培養(yǎng)方法，體外培養(yǎng)KFB，觀察生物學(xué)特征；應(yīng)用抗波形蛋白抗體做免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，證實(shí)為K

2、FB。2. KFB傳代培養(yǎng)后，選用第3~10代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KFB進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別加入含有ALA0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L、8.0mmol/L的無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液，避光培養(yǎng)4h后，光動(dòng)力儀照射，光源距離15cm，波長(zhǎng)630nm，光照密度為100mW/cm2,光照時(shí)間分別為100s、200s、400s、800s、1200s（即光照能量分別為10J/cm2、20

3、J/cm2、40J/cm2、80J/cm2、120J/cm2）。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，采用CCK8法檢測(cè)KFB增殖活性，選出最優(yōu)光敏劑濃度+光照能量組合（ ALA濃度為4.0mmol/L, PDT能量為80J/cm2）用于實(shí)驗(yàn)。3.將傳代培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況良好的 KFB分為5組，A組:空白對(duì)照組， B組:ALA組， C組:PDT組， D組:Caspase-8抑制劑+Caspase-9抑制劑+ALA+PDT，E組:ALA+PDT，以ALA濃度為4

4、mmol/L， PDT能量為80J/cm2進(jìn)行干預(yù)，流式細(xì)胞儀（Annexin-V/PI雙染色法）檢測(cè)各組 KFB的凋亡率；Western blot法檢測(cè)各組 KFB中凋亡蛋白：Caspase-3、GRP78、PERK、CHOP的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.組織塊接種后約5~7天可見(jiàn)到細(xì)胞爬出，培養(yǎng)30~40天左右，細(xì)胞可爬滿培養(yǎng)瓶瓶底80％，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或三角形，邊緣向外伸出數(shù)個(gè)突起；抗波形蛋白抗體免疫鑒定為陽(yáng)性，證實(shí)是成

5、纖維細(xì)胞。2. CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示:ALA-PDT干預(yù)后，KFB活性受到抑制，且在一定的范圍中，KFB的活性隨著 ALA濃度、PDT能量的增大而降低。3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組KFB凋亡率為：A組：0.13%、B組：4.89%、C組：5.44%、D組：21.81%、E組：63.85%；B、C、D、E組同A組比較，凋亡率上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；D組同B、C組比較，凋亡率明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；D組同

6、E組比較，凋亡率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；4. Western blot檢測(cè)顯示：B、C、D、E組中的Caspase-3、GRP78、PERK、CHOP較A組表達(dá)上調(diào)（P<0.05）；D、E組中Caspase-3、GRP78、PERK、CHOP的表達(dá)較B組、C組顯著上調(diào)（P<0.05）；與E組相比，D組Caspase-3的表達(dá)下調(diào)（P<0.05），而兩組之間的GRP78、PERK、CHOP表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05