伏馬菌素B1對正常食管上皮細胞的影響及其與食管癌關系的病例對照研究.pdf

1、大量流行病學調查表明，在一些食管癌高發(fā)區(qū)居民糧食中伏馬菌素B1(FB1)的污染水平明顯高于低發(fā)區(qū)，但FB1與食管癌的關系仍缺少實驗室的直接證據(jù)和人群病例對照研究資料。本研究采用人類正常食管上皮細胞培養(yǎng)技術，觀察FB1對人類正常食管上皮細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的作用，研究FB1對人類正常食管上皮細胞周期相關基因DNA甲基化、mRNA和蛋白表達的影響，同時在江蘇淮安食管癌高發(fā)地區(qū)選擇2007、2008及2009三年中進行手術的食管癌病例

2、152例，以同性別、年齡相差2歲以內的正常人按1∶1配對，收集食管癌組織、癌旁組織及血液標本，檢測細胞周期相關基因DNA甲基化、mRNA和蛋白的表達、血清中維生素A和二氫神經(jīng)鞘氨醇/神經(jīng)鞘氨醇(sphinganine/sphingosine，Sa/So)水平，開展病例對照研究，探討FB1在食管癌發(fā)生中的作用及其機制以驗證體外細胞實驗的結果，并分析維生素A與食管癌的關系，用體外實驗驗證維生素A的干預作用，為食管癌的一級預防措施的制定提供科

3、學依據(jù)。
　　研究結果如下：
　　1.FB1對人類正常食管上皮細胞的影響研究
　　用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/LFB1處理人類正常食管上皮細胞24h、48h、72h和96h，均可以促進細胞增殖。FB1處理72h時，40μmol/FB1組GO/G1期細胞比例、細胞凋亡比例明顯低于0μmol/LFB1組(p＜0.05)，S期和G2/M期細胞比例明顯高于0μmol/LFB1組(p＜0.

4、05);20μmol/LFB1組G0/G1期細胞比例明顯低于0μmol/LFB1組(p＜0.05)，S期細胞比例明顯高于0μmol/LFB1組(p＜0.05)，但G2/M期細胞比例、細胞凋亡比例與0μmol/LFB1組間無顯著差異(p＞0.05);5μmol/L、10μmol/LFB1組G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例、細胞凋亡比例與0μmol/LFB組間無顯著差異(p＞0.05)。
　　2.FB1對人類正常食管上皮細胞作用

5、的分子生物學機制研究
　　用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/LFB1處理人類正常食管上皮細胞72h，不同劑量的FB1處理的人類正常食管上皮細胞周期相關基因P16、P21等均未發(fā)生甲基化。10μmol/L、20μmol/L、40μmol/LFB1組均可上調CyclinD1基因的mRNA表達，下調CyclinE、P16、P21、P27基因的mRNA表達;5μmol/LFB1組可上調CyclinD1基因

6、的mRNA表達，下調CyclinE、P21基因的mRNA表達，但對P16、P27基因的mRNA表達無顯著影響。20μmol/L、40μmol/LFB1組均可下調CyclinE、P21、P27基因的蛋白表達，上調CyclinD1、PKC基因的蛋白表達;10μmol/LFB1組可下調CyclinE、P21、P27基因的蛋白表達，上調CyclinD1基因的蛋白表達，但對PKC基因的蛋白表達無顯著影響;而5μmol/FB1組對細胞周期相關基因的

7、蛋白表達均無顯著影響。
　　3.FB1內暴露、細胞周期相關基因DNA甲基化和mRNA表達、血清維生素A水平與食管癌關系的病例對照研究
　　食管癌病例組血清Sa水平明顯高于對照組(P＜0.001)，So水平明顯低于對照組(P＜0.01)，Sa/So水平顯著高于對照組(P＜0.0001)。食管癌病例組全血樣品P16、P21基因DNA甲基化率與對照組間比較，有顯著性差異（P均＜0.001）。食管癌病例組全血樣品CyclinE、P2

8、1、P27基因mRNA表達明顯低于對照組(P＜0.05)。食管癌病例組血清中維生素A的含量明顯低于對照組(P＜0.01)。用多因素logistic回歸分析結果表明，血清Sa/So水平、全血樣品P16基因甲基化是食管癌的危險因素，全血樣品P21、P27基因mRNA表達、血清維生素A水平是食管癌的保護因素。
　　4.細胞周期相關基因在食管癌患者癌組織和癌旁組織中的對比研究
　　食管癌患者癌組織P16、P21基因DNA甲基化率與癌

9、旁組織比較，有顯著性差異(P＜0.001;P＜0.05)。癌組織P16、P21、P27基因mRNA表達明顯低于癌旁組織(P＜0.05)，CyclinE基因mRNA表達明顯高于癌旁組織(P＜0.05)。癌組織CyclinE、CyclinD1和PKC的蛋白表達上調，而P21、P27基因蛋白表達下調。
　　5.維生素A對FB1處理的人類正常食管上皮細胞的干預作用研究
　　用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μ

10、mol/L的FB1處理人類正常食管上皮細胞同時加入10μmol/L維生素A干預24h、48h、72h和96h，其中40μmol/LFB1處理人類正常食管上皮細胞同時加入10μmol/L維生素A干預24h、48h、72h和96h，20μmol/LFB1處理人類正常食管上皮細胞同時加入10μmol/L維生素A干預72h和96h，維生素A均能抑制FB1的促進細胞增殖作用，其余干預組對FB1促進細胞增殖的作用無顯著影響。
　　用5μmol

11、/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的FB1處理人類正常食管上皮細胞同時加入10μmol/L維生素A干預72h，40μmol/LFB1處理人類正常食管上皮細胞同時加入10μmol/L維生素A干預組，維生素A能明顯改善FB1對S期阻滯和對人類正常食管上皮細胞凋亡的抑制作用，促進細胞進入G2/M期，其余干預組對FB1改變細胞周期和凋亡的作用無顯著影響。10μmol/L、40μmol/LFB1處理人類正常食管上皮細胞同時

12、加入10μmol/L維生素A干預組，維生素A能明顯下調FB1對CyclinD1基因mRNA表達的上調作用，上調FB1對CyclinE、P16、P21基因mRNA表達的下調作用;20μmol/LFB1處理人類正常食管上皮細胞同時加入10μmol/L維生素A干預組，維生素A能明顯下調FB1對CyclinD1基因mRNA表達的上調作用，上調FB1對CyclinE、P21基因mRNA表達的下調作用，但對FB1改變其他基因mRNA表達的作用無顯著

13、影響;其余干預組對FB1改變其他基因mRNA表達的作用無顯著影響。20μmol/L、40μmol/FB1處理人類正常食管上皮細胞同時加入10μmol/L維生素A干預組，維生素A能明顯下調FB1對CyclinD1基因蛋白表達的上調作用，上調FB1對CyclinE、P21、P27、PKC基因蛋白表達的下調作用;10μmol/LFB1處理人類正常食管上皮細胞同時加入10μmol/L維生素A干預組，維生素A均能明顯下調FB1對CyclinD1基

14、因蛋白表達的上調作用，上調FB1對CyclinE、P21、P27基因蛋白表達的下調作用，但對FB1上調PKC基因蛋白表達的作用無顯著影響;其余干預組對FB1改變其他基因蛋白表達的作用無顯著影響。
　　結論：FB1能夠促進人類正常食管上皮細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進細胞從G0/G1期進入S期，導致S期和G2/M期阻滯。其分子生物學機制可能通過促進PKC基因蛋白表達，在mRNA表達水平上調CyclinD1基因，下調P16、P21、P2

15、7基因，在蛋白表達水平上上調CyclinD1基因，下調P21、P27基因。人群病例對照研究提示FB1可能通過改變細胞周期調節(jié)因子的表達，提高食管癌的發(fā)病危險，同時FB1暴露與維生素A不足可能在食管癌的發(fā)生過程中有協(xié)同作用。食管癌患者癌組織P16、P21、P27基因mRNA表達明顯低于癌旁組織，CyclinD1、PKC基因mRNA表達與癌旁組織間比較在數(shù)值上有上調趨勢，癌組織CyclinD1和PKC的蛋白表達上調，而P21、P27基因蛋白