APOE亞型特異性影響繼發(fā)性神經細胞損傷的實驗研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經外科最常見的一種疾病，其死亡率、致殘率居各類創(chuàng)傷之首。腦傷后以細胞凋亡為主要特征的繼發(fā)性腦損傷是影響傷情轉歸的主要因素。載脂蛋白E基因(apolipoprotein E，APOE)主要有ε2、ε3、ε4三個等位基因，我們前期工作和國外研究顯示，攜帶ε4的患者對腦損傷的耐受性降低，更易出現(xiàn)傷情加重及不良預后。但是，APOE影響腦損傷病情轉歸的機制尚未闡明。Ca2+超

2、載是細胞死亡的“最終共同通路”，Ca2+超載實質是細胞內外離子失衡的結果。K+是維持細胞內離子環(huán)境最主要的陽離子，目前認為鉀通道也是細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)之一。本課題以APOE亞型特異性與延遲整流鉀通道的關系作為切入點，構建人源性ε2、ε3、ε4的真核表達載體，分別轉染APOE敲除鼠胚神經干細胞(neural stemcells，NSCs)，篩選穩(wěn)定表達細胞株，建立神經元/膠質細胞共培養(yǎng)劃痕損傷模型，采用流式細胞技術及膜片鉗技術分析傷后AP

3、OE亞型特異性與細胞早期凋亡、延遲整流鉀通道的關系，探討APOE影響繼發(fā)性神經細胞損傷的作用機制。 一、人源性APOE基因真核細胞表達載體的構建和鑒定人源胎腦組織中提取Total RNA后，設計引物調取APOEε3基因CDS區(qū)域，克隆至pMD19-T simple載體中并測序驗證，采用定點突變技術，得到APOEε2及APOEε4的重組突變體載體。EcoR I/BamHI雙酶切切下編碼APOE的片段，插入真核表達載體pEGFP-N

4、1。對重組質粒進行雙酶切、PCR和測序驗證后，采用陽離子脂質體Lipofectamine2000將重組質粒轉染至真核細胞(293-T細胞)中，用熒光顯微鏡觀察基因在239一-細胞中的表達情況。結果：雙酶切、PCR和質粒測序結果證明APOE各等位基因正確地克隆到真核表達載體pEGFP-N1中，并能在293-T真核細胞中進行融合表達。結論：成功構建了人源性pEGFP-N1-APOE各亞型的真核表達載體，并成功轉染真核細胞，為下一步實驗中各重

5、組質粒轉染APOE敲除鼠的NSCs奠定了基礎。二、穩(wěn)定表達pEGFP-N1-APOE的神經干細胞克隆的建立和鑒定采用APOE敲除鼠(E15d)的胎鼠腦組織為細胞來源，常規(guī)分離，培養(yǎng)和鑒定所得到的NSCs。將前期構建好的人源性APOE各等位基因重組質粒以陽離子脂質體Lipofectamine 2000轉染至NSCs中，在含有200μg/ml G418培養(yǎng)液中培養(yǎng)14d，以篩選穩(wěn)定表達pEGFP-N1-APOE的NSCs克隆。將穩(wěn)定表達的細

6、胞克隆進行單細胞克隆培養(yǎng)以純化穩(wěn)定表達人源性APOE各等位基因的NSCs。擴增穩(wěn)定表達目的基因的NSCs，用RT-PCR、Western Blot、激光共聚焦顯微鏡檢測目的基因在轉基因NSCs中的表達情況。結果：成功將前期構建的人源性APOE各重組質粒轉入APOE敲除鼠NSCs，經檢測證明穩(wěn)定表達EGFP的NSCs可表達人APOE各等位基因。結論：采用陽離子脂質體法可有效地將APOE各重組質粒轉染到NSCs，經過G418篩選后可以獲得穩(wěn)

7、定表達pEGFP-N1-APOE的NSCs克隆。三、APOE亞型特異性對神經細胞傷后早期凋亡的影響本實驗采用穩(wěn)定表達人APOE各等位基因的APOE敲除鼠NSCs，優(yōu)化誘導分化條件，構建神經元/膠質細胞共培養(yǎng)體系?？刂茥l件，利用微量移液器槍頭切割培養(yǎng)的神經元、膠質細胞，造成神經細胞機械性損傷，構建細胞劃痕損傷模型。參考文獻及預實驗結果設置時間點(6h、12h、24h、48h)，通過Annexin V/PI聯(lián)合流式細胞技術檢測損傷后各組細胞

8、早期凋亡率，分析人APOE各等位基因影響繼發(fā)性神經細胞損傷的差異。結果：成功構建攜帶人源性APOE各等位基因的細胞劃痕損傷模型；傷后各時間點均能檢測到早期凋亡細胞，24h時間點各組細胞早期凋亡率較6h、12h明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05)，且人APOEε4組及鼠APOE(一)組較其余組早期凋亡率明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05)。結論：轉染人APOEε4的細胞早期凋亡率高于其他組，從細胞水平為APOE多態(tài)性影響TBI病情及預

9、后的臨床研究結果提供了實驗依據(jù)。 四、APOE亞型特異性影響神經細胞早期凋亡的機制探討以APOE亞型特異性與延遲整流鉀通道相關性作為切入點，采用膜片鉗技術檢測各實驗組延遲整流鉀電流(ID)的差異。選擇邊緣清晰、大小相似的神經元樣細胞作為實驗對象，記錄致傷前后ID情況，并進行組間比較，進一步探討APOE影響神經細胞早期凋亡的病理機制。結果：(1)依據(jù)電生理特性證實各細胞組所記錄到的外向電流為ID。且發(fā)現(xiàn)未受傷狀態(tài)下各組神經細胞的I