神經(jīng)干細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控能力的研究.pdf

1、目的：研究能夠調(diào)控外源基因在神經(jīng)干細(xì)胞中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。
　　方法：PCR擴(kuò)增出小鼠Nestin啟動(dòng)子全序列(4000bp)、核心序列(400bp)和內(nèi)含子-2；以pcDNA3.1為模板，構(gòu)建6種重組質(zhì)粒，分別用CMV、CMV+內(nèi)含子-2、Nestin啟動(dòng)子全序列、Nestin啟動(dòng)子全序列+內(nèi)含子-2、Nestin啟動(dòng)子核心序列、Nestin啟動(dòng)子核心序列+內(nèi)含子-2作為啟動(dòng)子調(diào)控報(bào)告基因EGFP表達(dá)；6種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Ne

2、stin+、Nestin-細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)EGFP表達(dá)，同時(shí)采用流式細(xì)胞儀法測定細(xì)胞EGFP表達(dá)率。用Nestin啟動(dòng)子核心序列與內(nèi)含子-2序列融合作為啟動(dòng)子，構(gòu)建慢病毒載體，感染神經(jīng)干細(xì)胞，檢測啟動(dòng)子在神經(jīng)干細(xì)胞中調(diào)控能力。RT-PCR獲得小鼠IGF-1基因的cDNA，構(gòu)建IGF-1基因重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，ELISA、Western blot檢測其表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)啟動(dòng)子調(diào)控真核基因的能力。經(jīng)質(zhì)粒抽提

3、、酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲取克隆的IGF-1重組質(zhì)粒。
　　結(jié)果：經(jīng)測序鑒定，克隆出的Nestin啟動(dòng)子序列、內(nèi)含子-2與Genbank中公布序列一致。酶切鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建的重組質(zhì)粒完全正確。Nestin啟動(dòng)子全序列及核心序列都能非特異性調(diào)控EGFP基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且具有較強(qiáng)調(diào)控能力；與內(nèi)含子-2融合后，只能特異性調(diào)控EGFP基因在Nestin+細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，CMV啟動(dòng)子與內(nèi)含子-2序列融合只具有非特異性調(diào)控能力。