桂枝湯苯丙烯類化合物解熱構(gòu)效關(guān)系及PGE-,2-釋放與TRPV4相關(guān)性研究.pdf

1、桂枝湯(由桂枝、芍藥、甘草、生姜、大棗組成)是治療太陽中風(fēng)的主方，能解肌發(fā)表，調(diào)和營衛(wèi)，用于外感風(fēng)寒表虛證。本課題組自1985年以來，以張仲景對桂枝湯功能論述為依據(jù)，運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，對桂枝湯進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究。其中，桂枝湯解熱有效部位A(Fr.A)在很小劑量即顯示了明顯的解熱活性，并可降低發(fā)熱動(dòng)物下丘腦PGE<,2>含量，經(jīng)LC/MS、GC/MS和化學(xué)分離確證，其內(nèi)含十余種苯丙烯類化合物，此類化合物為該部位的主要成分。 近年

2、來已成功克隆了數(shù)個(gè)與感受溫度相關(guān)的生物分子的基因，明確了它們編碼的蛋白質(zhì)是屬于瞬變感受器電位蛋白(transient receptor potential，TRP)家族。其中，發(fā)現(xiàn)TRP vanilloid 4(TRPV4)可感受生理范圍(>27℃)以內(nèi)的溫度刺激且在下丘腦出現(xiàn)表達(dá)，表明TRPV4可能是下丘腦區(qū)傳遞溫?zé)岽碳さ膿Q能裝置。中藥活性物質(zhì)對TRP通道的作用是否參與了體溫調(diào)節(jié)是值得探索的領(lǐng)域，我們期望能進(jìn)一步闡明苯丙烯類化合物解熱

3、作用機(jī)理，從而為揭示"中藥及其復(fù)方由活性物質(zhì)群構(gòu)成，活性物質(zhì)群按一定要求配伍組合，通過機(jī)體的多靶點(diǎn)、多途徑經(jīng)整合發(fā)揮作用"的實(shí)質(zhì)作出貢獻(xiàn)。 鑒于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和PGE<,2>在發(fā)熱反應(yīng)中的重要地位，本研究論文以小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b.End3)為研究對象，觀察桂枝湯主要有效成分苯丙烯類化合物對IL-1β刺激b.End3細(xì)胞釋放PGE<,2>的影響，計(jì)算IC<,50>并分析其構(gòu)效關(guān)系；在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇抑制效果最佳的

4、單體化合物桂皮醛作為代表藥物，進(jìn)行整體動(dòng)物解熱鎮(zhèn)痛抗炎實(shí)驗(yàn)，探討苯丙烯類化合物解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用及解熱機(jī)制；利用RealtimeRT-PCR、Western blot、熒光細(xì)胞免疫化學(xué)和ELISA等多種技術(shù)方法觀察桂皮醛對IL-1β刺激下b.End3細(xì)胞內(nèi)TRPV4表達(dá)的影響，以期探討PGE<,2>釋放與TRPV4的相關(guān)性。 一、桂枝湯苯丙烯類化合物對IL-1β刺激b.End3細(xì)胞分泌PGE<,2>的影響及構(gòu)效關(guān)系研究本實(shí)驗(yàn)在以往

5、研究桂枝湯全方或Fr.A的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，我們收集或合成苯丙烯類化合物共計(jì)33種進(jìn)行試驗(yàn)，以b.End3細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，以不同濃度苯丙烯類化合物予以干預(yù)，ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中PGE<,2>的含量，計(jì)算各化合物ICso并分析構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果顯示苯丙烯類化合物對IL-1β刺激b.End3細(xì)胞釋放PGE<,2>具有不同程度的抑制作用，其中桂皮醛類化合物呈現(xiàn)出較好的抑制作用，桂皮醇類化合物次之，桂皮酸類化合物作用較差，其作用強(qiáng)度與側(cè)鏈取

6、代基的位置和數(shù)目密切相關(guān)，呈現(xiàn)一定的構(gòu)效關(guān)系。 二、桂皮醛對整體動(dòng)物解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用及解熱機(jī)制的研究本實(shí)驗(yàn)以桂皮醛作為苯丙烯類化合物的代表藥物，采用酵母發(fā)熱大鼠模型，觀察桂皮醛的解熱作用；采用ELISA方法測定致熱大鼠下丘腦組織PGE<,2>含量，探討桂皮醛解熱機(jī)制；采用小鼠扭體法和熱板法，觀察桂皮醛鎮(zhèn)痛作用；通過小鼠耳腫脹及對腹腔毛細(xì)血管通透性的影響觀察桂皮醛抗炎作用。結(jié)果顯示桂皮醛能顯著減輕酵母所致大鼠發(fā)熱反應(yīng)；顯著降低發(fā)熱

7、大鼠下丘腦PGE<,2>含量；明顯提高熱板痛閾和抑制醋酸所致扭體反應(yīng)；亦能顯著抑制腹腔毛細(xì)血管通透性的增高及二甲苯所致小鼠耳廓腫脹。提示，桂皮醛具有明顯的解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用，其解熱機(jī)制可能與影響下丘腦PGE2含量有關(guān)。 三、桂皮醛解熱機(jī)制--PGE<,2>釋放與TRPV4相關(guān)性的探討本實(shí)驗(yàn)以b.End3細(xì)胞為研究對象，以桂皮醛和TRPV4通道的阻斷劑釕紅(ruthenium red，RR)預(yù)處理后，用30ng-mL<'-1>的IL

8、-1β刺激，應(yīng)用Realtime RT-PCR技術(shù)測定TRPV4 mRNA表達(dá)變化，用Westem blot技術(shù)和熒光免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測其蛋白表達(dá)水平，并同步測定細(xì)胞上清中PGE<,2>含量的變化，以期觀察PGE<,2>釋放與TRPV4的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示b.End3細(xì)胞中存在TRPV4 mRNA和蛋白表達(dá)，IL-1β可增高b.End3細(xì)胞TRPV4.mRNA和蛋白的表達(dá)；釕紅可顯著降低正常和IL-1β刺激下b.End3細(xì)胞TRPV

9、4 mRNA和蛋白的表達(dá)；桂皮醛(0.38mmol·L<'-1>)可降低IL-1β刺激下b.End3細(xì)胞TRPV4.mRNA和蛋白的表達(dá)，但作用弱于釕紅。ELISA法同步測定細(xì)胞上清中PGE<,2>含量，結(jié)果顯示IL-1β刺激后b.End3細(xì)胞培養(yǎng)液中的PGE<,2>的含量顯著升高，與對照組比較有顯著差異。桂皮醛顯著降低細(xì)胞的培養(yǎng)液中PGE<,2>含量，而釕紅對正常和IL-1β刺激后細(xì)胞的培養(yǎng)液中PGE2含量均無明顯改變。綜上可見，TR