新型喹唑啉類化合物生物活性測定及定量構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、在自身免疫耐受及移植免疫耐受的誘導(dǎo)和維持中CD4+ Foxp3+ Treg起重要作用。通過免疫抑制劑誘導(dǎo)特異性的CD4+ Foxp3+ Treg細胞,將提高器官移植受者免疫耐受的敏感性,有利于器官移植物的長期存活及移植免疫耐受的建立。目前,臨床上使用的免疫抑制藥物主要有環(huán)孢素、他克莫司、霉酚酸酯等。以雷帕霉素為代表的第三代免疫抑制劑在避免移植排斥反應(yīng)的同時,也具有部分誘導(dǎo)CD4+ Foxp3+ Treg細胞的能力,逐漸成為免疫抑制劑中的

2、主力軍。因此,開發(fā)具有顯著誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性 T細胞能力的新型免疫抑制劑是免疫抑制藥物研發(fā)的重要發(fā)展方向。
　　化合物進入體內(nèi)后其作用模式是一個連續(xù)且復(fù)雜的過程,因此探明其在體內(nèi)及體外免疫抑制模式及分子作用機制至關(guān)重要。本研究通過前期大量的實驗,篩選出一種具有誘導(dǎo)人外周血T淋巴細胞向Treg細胞分化的喹唑啉類化合物。為進一步提高其誘導(dǎo)免疫抑制的效果,本課題進行了分子模擬及定量構(gòu)效關(guān)系研究,并在此基礎(chǔ)上設(shè)計、合成了一系列新型喹唑啉類化合物,

3、通過對體內(nèi)及體外細胞生物學(xué)活性的初步探討,及時地為化學(xué)合成反饋信息,以期為高特異性、高活性的新型免疫抑制劑的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
　　本課題研究的主要內(nèi)容如下:
　　1)新型喹唑啉類化合物的設(shè)計
　　采用分子對接技術(shù)模擬藥物分子在JAK3活性位點處的結(jié)合模式,并借助SYBYL6.9分子模擬軟件進行分子結(jié)構(gòu)特征與免疫抑制活性間的三維定量構(gòu)效關(guān)系研究,基于上述信息設(shè)計新型喹唑啉類化合物;
　　2)新型喹唑啉類化合物的合

4、成及結(jié)構(gòu)鑒定
　　以2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲腈及2-氨基-5-R-苯甲腈(R:F、Cl、Br、CF3、CH3、NO2)為原料合成6,7-二甲氧基-4-環(huán)戊胺喹唑啉及6-R-4-環(huán)戊胺喹唑啉(R:F、Cl、Br、CF3、CH3、NO2、NH2)。通過高效液相色譜(HPLC)分析純度并使用質(zhì)譜測定相關(guān)分子量;
　　3)新型喹唑啉類化合物的生物活性測定
　　體外活性:采用CFSE標記細胞技術(shù)及Annexin V-FIT

5、C/PI雙染色法檢測合成化合物的體外生物學(xué)活性;
　　體內(nèi)活性:用ΔLM-OVA細菌免疫C57B1/6小鼠后,讓其服用上述化合物。7天后,取外周血并分離淋巴細胞,通過流式細胞術(shù)檢測CD8+IFN-γ+T細胞的比例,以此鑒定化合物的體內(nèi)活性。
　　通過上述研究,取得了以下研究成果:
　　1)利用分子模擬及三維定量構(gòu)效關(guān)系研究,成功地設(shè)計出8個新型喹唑啉類化合物,即6-R-4-環(huán)戊胺喹唑啉(R:F、CI、Br、CF3、CH

6、3、NO2、NH2)與6,7-二甲氧基-4-環(huán)戊胺喹唑啉。經(jīng)高效液相色譜及質(zhì)譜鑒定化合物純度均為100％;
　　2)通過流式細胞術(shù)檢測細胞表面CFSE熒光強度,可發(fā)現(xiàn)該類化合物均對細胞增殖具有抑制作用,其中以6,7-二甲氧基-4-環(huán)戊胺喹唑啉及6-R-4-環(huán)戊胺喹唑啉(R:Br,CF3)的抑制作用最為明顯,且該抑制作用與濃度呈正向相關(guān)性;
　　3) Annexin V-FITC/PI雙染色法結(jié)果證明,8種化合物均對細胞具有凋

7、亡誘導(dǎo)效應(yīng),且與上述結(jié)果相似,以6,7-二甲氧基-4-環(huán)戊胺喹唑啉及6-R-4-環(huán)戊胺喹唑啉(R: Br,CF3)的效果最為顯著。隨著喹唑啉類化合物濃度增高,細胞凋亡數(shù)逐漸增加,呈現(xiàn)一定的量-效關(guān)系;
　　4)在ΔLM-OVA細菌免疫后,服用喹唑啉類化合物的實驗組小鼠相對空白組小鼠,其OVA特異性CD8+IFN-γ+T細胞比例明顯降低(P<0.01)。
　　研究結(jié)果表明:本課題所設(shè)計的新型喹唑啉類化合物不僅在體外具有較強的生