HBV感染巨噬細(xì)胞的可能途徑及HBx誘導(dǎo)Grp78與MHC-I類(lèi)分子表達(dá)的研究.pdf

1、目的：研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(HBV)可以感染多種免疫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞能否被HBV感染及其感染機(jī)制目前尚不清楚。微顆粒是具有雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的囊狀小體,多項(xiàng)研究表明其可作為細(xì)胞間傳遞信息和物質(zhì)的載體。本研究從HBV陽(yáng)性患者外周血中分離微顆粒與巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)后,檢測(cè)巨噬細(xì)胞HBV顆粒以及不同蛋白的表達(dá),探討微顆粒介導(dǎo)HBV感染巨噬細(xì)胞的可能性，進(jìn)一步探討HBV感染細(xì)胞后對(duì)Grp78及MHC-Ⅰ表達(dá)的調(diào)控作用。
　　方法：

2、>　　1.從HBV陽(yáng)性患者的外周血中分離微顆粒作為實(shí)驗(yàn)組,來(lái)自HBV陰性個(gè)體外周血的微顆粒作為對(duì)照組;
　　2.從兩組中采集一部分微顆粒做熒光染色(PKH-26標(biāo)記微顆粒,FITC標(biāo)記HBV),并使用激光共聚焦顯微鏡觀察微顆粒內(nèi)是否包涵HBV,其余微顆粒與巨噬細(xì)胞(U937細(xì)胞)混合培養(yǎng)8h及24h;
　　3.采用PKH-26和CFSE分別對(duì)微顆粒和巨噬細(xì)胞染色;
　　4.采用激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)微顆粒;

3、r>　　5.采用透射電鏡觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)HBV病毒顆粒;
　　6.采用細(xì)胞免疫組化方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)HBcAg表達(dá);ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)和上清內(nèi)HBsAg和HBeAg的表達(dá);采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)HBcAg和HBx蛋白表達(dá);
　　7.采用real-timePCR方法分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和HBV-cccDNA水平,同時(shí)檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA水平;
　　8.分離提取被HBV感染的巨

4、噬細(xì)胞釋放的微顆粒,與新的巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)后采用real-timePCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平。
　　9.傳染HBx質(zhì)粒至HepG2細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)研究HepG2細(xì)胞表面MHC-Ⅰ、Grp78和MICA/B分子的表達(dá)情況;
　　10.采用雙光子共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞表面MHC-Ⅰ分子和Grp78分子的定位情況;
　　11.通過(guò)siGrp78和HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染以及siHLA和HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞,

5、采用流式細(xì)胞術(shù)研究HepG2細(xì)胞表面MHC-Ⅰ及Grp78分子的表達(dá);
　　12.轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒至T2細(xì)胞和H22細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)研究?jī)煞N細(xì)胞表面MHC-Ⅰ、Grp78分子的表達(dá);
　　13.將NK細(xì)胞與轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒的H22細(xì)胞共同培養(yǎng),采用流式細(xì)胞術(shù)觀察NK細(xì)胞對(duì)后者的殺傷效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1.共聚焦顯微鏡觀察可見(jiàn)來(lái)自HBV陽(yáng)性患者外周血的微顆粒內(nèi)包涵有HBV?；旌吓囵B(yǎng)8h后,可在巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)微顆

6、粒。
　　2.混合培養(yǎng)24h后,可通過(guò)透射電鏡在HBV陽(yáng)性組巨噬細(xì)胞內(nèi)觀察到HBV病毒顆粒。
　　3.混合培養(yǎng)24h后,經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)HBcAg染色呈陽(yáng)性,細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)到巨噬細(xì)胞內(nèi)有HBcAg和HBx蛋白表達(dá);而對(duì)照組未觀察到病毒顆粒以及HBcAg及HBx蛋白表達(dá);
　　4.ELISA結(jié)果提示HBV陽(yáng)性組巨噬細(xì)胞通過(guò)凍融和裂解兩種方法提取的抗原及培養(yǎng)上清內(nèi)的HBsAg和HBeAg表達(dá)呈陽(yáng)性,對(duì)照組

7、則呈陰性;
　　5.定量分析結(jié)果顯示,混合培養(yǎng)24h以后,實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、HBV-cccDNA水平和巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液的HBV DNA水平均明顯高于對(duì)照組;
　　6.分離提取了三代被HBV感染的巨噬細(xì)胞釋放的微顆粒,與未感染的巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)后,結(jié)果提示,連續(xù)四代細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平均呈陽(yáng)性。
　　7.轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒后HepG2細(xì)胞MHC-Ⅰ和Grp78表達(dá)升高,MICA/B分子表達(dá)則無(wú)明顯變化;<

8、br>　　8.雙光子共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞表面MHC-Ⅰ分子和Grp78分子表現(xiàn)為共定位情況,提示二者以復(fù)合體形式存在于細(xì)胞表面;
　　9.SiGrp78和HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染以及siHLA和HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)MHC-Ⅰ與Grp78分子的表達(dá)具有相關(guān)性。
　　10.NK細(xì)胞對(duì)于轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒的H22細(xì)胞殺傷效率下降。
　　結(jié)論：HBV陽(yáng)性患者外周血的微顆粒包涵有HBV,并可介導(dǎo)感染巨噬細(xì)胞,提示