人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染和MHC-I類分子表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生關(guān)系的研究.pdf

1、目的:人乳頭瘤狀病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一種嗜上皮性的球形DNA病毒，能引起皮膚黏膜的鱗狀上皮增生。1978年HaraldzurHansen提出HPV可能是性傳播致癌的因素，并證實(shí)宮頸癌的發(fā)生與HPV的直接關(guān)系。之后研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)HPV可能與直腸癌、食管癌、口腔癌、扁桃體癌等疾病有關(guān)。HPV DNA在宿主細(xì)胞中有二種存在方式，即整合狀態(tài)和游離狀態(tài)（染色體外的附加形式），在癌前組織中病毒常位于染色體外，而

2、在癌癥進(jìn)展期，病毒DNA以單拷貝或多拷貝串聯(lián)形式整合到宿主細(xì)胞DNA中，其結(jié)合位點(diǎn)多位于E2基因附近，結(jié)果導(dǎo)致HPV E2基因?qū)6、E7基因啟動的負(fù)向調(diào)節(jié)作用缺乏，使E6、E7基因表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞生長失控。主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(Major HistocompatibilityComplexⅠ，MHC-Ⅰ)參與內(nèi)源性抗原（病毒抗原、腫瘤抗原等）加工、處理，其作用是將蛋白抗原處理成抗原肽，呈遞給抗原特異性T淋巴細(xì)胞，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，

3、清除有害抗原。有研究發(fā)現(xiàn)食管癌、胃癌、大腸癌、肺癌、宮頸癌中MHC-Ⅰ類相關(guān)分子蛋白表達(dá)下調(diào)，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)DON（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）可使食管上皮細(xì)胞及人單個核細(xì)胞中HLA-Ⅰ、Calnexin、TAP1、LMP2表達(dá)降低。許多病毒可感染人的皮膚和黏膜組織，干擾MHC-Ⅰ抗原提呈過程，使其逃避宿主免疫應(yīng)答。惡性腫瘤的發(fā)生是多種因素參與的過程，除與病毒感染有關(guān)外，機(jī)體免疫狀況也發(fā)揮著重要作用。有研究者發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌與HPV感染

4、有關(guān)，HPV感染人食管鱗狀上皮后，其E6、E7致癌基因異常表達(dá)，E6可使抑癌基因P53基因失活，而E7則與抑癌基因PRb有關(guān)。在宮頸癌發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)高危型HPV的E5基因可以下調(diào)MHC-Ⅰ類分子蛋白表達(dá)，抑制腫瘤抗原提呈，使其無法被清除，被認(rèn)為是宮頸癌的致癌機(jī)制之一。但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌形成后，E5基因丟失，而在宮頸癌前病變中如CINI級中可以檢測到E5基因，所以有學(xué)者認(rèn)為E5基因只在癌癥發(fā)生前起作用。基于以上研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)

5、設(shè)想E5基因是否影響HPV感染的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中MHC-Ⅰ分子蛋白表達(dá)以及是否通過E5基因而發(fā)揮其作用。本課題擬應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、免疫組織化學(xué)等方法，對河北省中南部地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌患者HPV感染情況及抗原提呈過程中相關(guān)分子（HLA-a/b/c、Calnexin、TAP1、LMP2）蛋白表達(dá)進(jìn)行分析研究，初步揭示HPV感染對MHC—Ⅰ類分子蛋白表達(dá)的影響和在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　

6、1標(biāo)本收集
　　收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科2009-2012年食管鱗狀細(xì)胞癌與癌旁黏膜石蠟組織112例，要求癌旁黏膜組織未有癌組織侵犯。
　　病例資料包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、家族史（三代以內(nèi)的近親）、腫瘤組織學(xué)分化程度和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。
　　2 DNA提取
　　應(yīng)用天根amp FFPE DNA試劑盒提取鱗癌組織和癌旁黏膜DNA，使用Nanodrop2000C(Thermo Scientific，W

7、altham，MA，USA)儀器鑒定所提DNA純度。對石蠟包埋組織，取2ul DNA提取液滴加到測定孔處，設(shè)定A260(∶)A280值在1.80-2.20被認(rèn)為污染物少，DNA純度符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　3聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
　　所有標(biāo)本提取出的DNA用HPV L1基因擴(kuò)增，以檢測HPV感染情況。并且檢測HPV陽性的組織中E5基因擴(kuò)增情況。
　　4免疫組織化學(xué)法
　　免疫組織化學(xué)法分別檢測鱗癌組織與癌旁黏膜組織中

8、MHC-Ⅰ分子蛋白表達(dá)情況，用光學(xué)顯微鏡對免疫組化結(jié)果分析，判斷其蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1本組食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床病理特征分析結(jié)果
　　統(tǒng)計結(jié)果表明，患者年齡、性別、吸煙是食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的重要影響因素，112例食管鱗狀細(xì)胞癌患者中年齡大于50歲、男性和吸煙者所占的比例明顯高于小于50歲、女性和不吸煙者。而且進(jìn)一步的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，吸煙和飲酒者HPV的感染率明顯高于不吸煙和不飲酒者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.

9、05)。
　　2本組食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HPV感染情況
　　PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，112例食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中有22例檢測出了HPV L1基因，本組食管鱗狀細(xì)胞癌HPV的感染率為19.6％(22/112)，其中HPV-16型為感染最多的亞型45.5％(10/22)。
　　3食管鱗狀細(xì)胞癌組織中MHC-Ⅰ類分子蛋白表達(dá)情況
　　免疫組化結(jié)果顯示:食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HLA-a/b/c、Calnexin、TAP1和LM

10、P2蛋白陽性表達(dá)率分別為36.6％(41/112)、50.0％(56/112)、25.9％(29/112)和42.0％(47/112)，均分別明顯低于癌旁黏膜組織表達(dá)的陽性率58.0％(65/112)、93.8％(105/112)、77.7％(87/112)和84.8％(95/112),兩者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4 HPV感染對食管鱗狀細(xì)胞癌組織MHC-Ⅰ類分子蛋白表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果結(jié)果顯示:H

11、PV陽性的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HLA-a/b/c、TAP1蛋白陽性表達(dá)率為18.2％(4/22)、45.5％(10/22)，明顯低于HPV陰性的食管鱗狀細(xì)胞癌組織41.1％(37/90)、78.9％(71/90)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而Calnexin、LMP2蛋白表達(dá)的陽性率在HPV陽性和陰性組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5 HPV E5基因PCR檢測結(jié)果:
　　在HPV陽性的食管鱗狀細(xì)胞癌組織

12、及癌旁黏膜組織中，均未檢測到E5基因。
　　結(jié)論:
　　1本組食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HPV感染率為19.6％，低于中國其他食管癌高發(fā)區(qū)。提示HPV感染是影響該地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的因素之一，但不是主要影響因素。
　　2食管鱗狀細(xì)胞癌中HLA-a/b/c、 Calnexin、TAP1和LMP2蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，提示在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中MHC-Ⅰ類分子抗原提呈過程的異常參與了食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生。