斑點(diǎn)叉尾鮰（Channel catfish）魚(yú)皮膠原蛋白及膠原蛋白多肽的研究.pdf

1、以斑點(diǎn)叉尾鲴魚(yú)皮為原料，提取了可溶性和不溶性膠原，并以膠原的性質(zhì)為基礎(chǔ)，優(yōu)化了提取明膠的工藝條件。同時(shí)，以斑點(diǎn)叉尾鲴魚(yú)皮明膠為原料，采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解的方法生產(chǎn)出具有清除自由基能力的膠原蛋白多肽。利用小鼠皮膚的光老化模型，研究了膠原蛋白多肽清除光老化皮膚中自由基的能力。利用生物化學(xué)方法從膠原蛋白多肽中分離出一條具有高度抗氧化能力的多肽，經(jīng)多級(jí)質(zhì)譜鑒別為九肽。 采用乙酸溶解和胃蛋白酶分解的方法首次從斑點(diǎn)叉尾鲴魚(yú)皮中分離得

2、到可溶性和不溶性膠原，并對(duì)其部分定性。研究結(jié)果表明斑點(diǎn)叉尾鲴魚(yú)皮膠原含有的甘氨酸約占2396，羥脯氨酸含量在7.3～7.59％?？扇苄阅z原的變性溫度為34.8℃，比豬皮可溶性膠原變性溫度低3℃。電泳結(jié)果表明斑點(diǎn)叉尾鲴魚(yú)皮膠原含有兩條分子量相同的Q肽鏈，而不同于大部分真骨魚(yú)含有的3條分子量不相同α肽鏈?？扇苄阅z原和不溶性膠原的得率分別為25.8％與38.4％。 分別利用飽和Ca(OH)<,2>溶液和低濃度H2<,2>O<,4>溶液

3、對(duì)魚(yú)皮進(jìn)行預(yù)處理，然后利用熱水抽提的方法制取明膠。以凝膠強(qiáng)度為主要指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，得到優(yōu)化工藝條件：預(yù)處理魚(yú)皮經(jīng)濃度為1.6g/L Ca(OH)<,2>浸泡，浸泡時(shí)間為67h，提取pH為5.0～5.5，提取溫度為43.2℃，提取時(shí)間為5.75h；濃度為0.5mL/L的H<,2>SO<,4>浸泡時(shí)間為17.3h，提取pH為3.5～4.0，提取溫度為54.3℃，提取時(shí)間為5.89h。 分別對(duì)酸法明膠和堿法明膠的物理

4、和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。傅立葉紅外轉(zhuǎn)換掃描結(jié)果表明，兩種明膠均具有一定的與膠原相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)；在最佳工藝條件下制取的明膠具有很高的凝膠強(qiáng)度，酸法明膠的Bloom強(qiáng)度為271 Bloom，堿法明膠的Bloom強(qiáng)度為265 Bloom；酸法明膠和堿法明膠的等電點(diǎn)各為7.3和4.1。堿法明膠比酸法明膠都具有很高的粘度，分別為10.52±0.5 mPa.s和8.38±0.3 mPa.s。但是明膠的流變性表明堿法明膠的凝固點(diǎn)和熔點(diǎn)要低于酸法明膠。最

5、佳工藝下的明膠的凝膠能力均好于試劑級(jí)豬皮明膠，這表明斑點(diǎn)叉尾鲴魚(yú)皮明膠可以作為豬皮明膠的潛在替代品。 利用斑點(diǎn)叉尾鲴魚(yú)皮明膠水解制取了護(hù)膚性的、具有自由基清除能力的膠原蛋白多肽。結(jié)果表明，魚(yú)皮明膠的酶水解物的自由基清除能力高于用酸、堿水解的產(chǎn)物；堿性蛋白酶Alcalase水解堿法明膠可以在寬泛的時(shí)間范圍內(nèi)產(chǎn)生較高的自由基清除能力。經(jīng)條件優(yōu)化后，堿性蛋白酶Alcalase在底物濃度為45g/L、酶與底物比為2000U/g、水解液p

6、H為7、水解溫度為60℃的條件下，膠原蛋白多肽的·OH和O<,2>清除率分別為88.33％和41.1％；經(jīng)過(guò)胰蛋白酶的再次酶解，膠原蛋白多肽的·OH和O<,2><'·->清除率分別達(dá)到了95.24％和53.7％。膠原蛋白多肽具有很高的體外清除自由基的能力，平均分子量小于2,000Da，溶解性良好，具有一定的保濕性。 試驗(yàn)表明，膠原蛋白多肽具有減輕小鼠皮膚光老化的作用。確定了小鼠皮膚在UVB照射下的光老化模型。組織切片和組織內(nèi)羥脯

7、氨酸含量及各抗氧化體系活力的測(cè)定結(jié)果表明，模型組和空白組之間存在著顯著差異。小鼠皮膚外觀觀察與組織切片表明，外涂高濃度膠原蛋白多肽組小鼠表皮要比模型組薄，說(shuō)明其對(duì)光老化造成的表皮增生有一定治療作用；外涂膠原蛋白多肽組小鼠皮膚中羥脯氨酸含量比模型組含量高，但是比空白組低。這說(shuō)明膠原蛋白多肽對(duì)光老化皮膚中羥脯氨酸的減少又緩解作用，但是不能使損傷皮膚達(dá)到原有水平。涂抹膠原蛋白多肽組小鼠皮膚組織內(nèi)SOD及GSH-Px活力均比模型組高，而MDA含

8、量均低于模型組?？梢酝茢嗄z原蛋白多肽可以清除自由基，通過(guò)抑制皮膚中的活性氧簇NOS和增強(qiáng)抗氧化酶的作用抑制皮膚損傷。 通過(guò)體外抗氧化測(cè)定系統(tǒng)，以·OH清除率為指標(biāo)，依次以SP-Sephadex C-25離子柱、SP-Sephadex G-25體積排阻凝膠柱、中壓反向液相純化系統(tǒng)、高壓液相分離純化具有自由基清除能力的膠原蛋白多肽，得到序列為H-Gly．Pro-Leu．Ser-Gly-Pro-Gly-Hyp-Arg-OH(855.4