PD-1對再生障礙性貧血T細胞功能異常的作用及其機制研究.pdf

1、再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種由T細胞異?；罨鸬囊栽煅M織為靶細胞的特殊的自身免疫性疾病，T細胞的異?；罨赡芘c共刺激分子表達及功能異常有關(guān)。 目的：研究協(xié)同刺激分子PD-1（Programmed Death-1）對再生障礙性貧血中T細胞異常調(diào)節(jié)的作用及其機制；觀察川芎嗪治療的再生障礙性貧血患者T細胞PD-1和sPD-1的變化及體外川芎嗪對T細胞增殖和細胞因子分泌的影響。 方法：

2、 1）、應(yīng)用兩株識別位點不同的鼠抗人PD-1分子單克隆抗體1F2和5F10，采用1F2作為包被抗體，5F10經(jīng)生物素（biotin）標(biāo)記后作為檢測抗體，建立雙單抗夾心的人可溶性PD-1（sPD-1）酶標(biāo)檢測方法，并對健康供血員、血液病患者及移植等病人血清中sPD-1的含量進行了檢測。 2）、應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測AA患者外周血和骨髓中CD4+和CD8+T細胞表面PD-1的表達；并用自主研制的sPD-1ELISA試劑盒，檢測臨床AA

3、患者血清中sPD-1含量，觀察sPD-1在體外對T細胞增殖和IL-2和IFN—γ分泌的影響，并應(yīng)用Real—time PCR檢測AA患者血清中不同PD-1剪輯的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達水平。 3）、觀察2例臨床應(yīng)用川芎嗪治療1個月的再障患者治療前后的T細胞表面標(biāo)記PD-1、CD4、CD8、CD25和血清中sPD-1表達水平的變化。應(yīng)用MTT法檢測體外實驗中川芎嗪對正常人和AA患者外周血T細胞增殖的作用；應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測川芎嗪對CD4+和

4、CD8+T細胞上CD25（IL-2R）的表達及PD-1表達的影響；應(yīng)用ELISA法檢測細胞因子IL-2、IFN—γ和sPD-1的水平變化。 結(jié)果： 1）、成功研制了人sPD-1酶聯(lián)檢測試劑盒，用該試劑盒測得血清中sPD-1的正常值為1．103±0．240ng/ml，AA患者血清中sPD-1的含量明顯高于正常對照組，而甲亢和器官移植病人血清中sPD-1的含量和正常值相比沒有顯著差異。 2）、流式結(jié)果顯示，AA患者外

5、周血和骨髓中CD4+和CD8+T細胞低表達PD-1，而ELISA結(jié)果顯示，血清中高表達sPD-1； Real—time PCR結(jié)果顯示，sPD-1可能是PD-1△ex3變異體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；且此sPD-1能上調(diào)T細胞增殖和細胞因子IL-2和IFN—γ的分泌。 3）、臨床川芎嗪治療2例有效病例結(jié)果表明，川芎嗪能上調(diào)T細胞上CD4、下調(diào)CD8、CD25分子以及血清中sPD-1的表達水平。川芎嗪體外能明顯抑制正常的和AA患者T細胞的增殖和

6、活化，并降低IL-2和IFN—γ的水平，能抑制CD4+和CD8+T細胞上CD25的表達，能上調(diào)AA患者T細胞上PD-1的表達以及降低上清中sPD-1的表達水平，對正常人T細胞上PD-1作用不明顯。 結(jié)論：AA中T細胞的異?；罨cPD-1分子和功能的異常有關(guān)，其作用機制可能是：PD-1△ex3的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物sPD-1在AA患者血清中的高水平表達，導(dǎo)致sPD-1作為一種與PD—L特異性結(jié)合的自身抗體，從而阻斷PD-1/PD—L的信號通路

7、，上調(diào)T細胞的活化增殖和細胞因子的分泌，增強了T細胞對造血細胞的毒性以及造血抑制因子IFN—γ對造血細胞的作用，最終導(dǎo)致AA的發(fā)生。川芎嗪治療AA的可能機制是：川芎嗪對免疫過激T細胞具有一定的抑制作用，其對T細胞的免疫抑制作用可能與降低IL-2和IFN—γ的分泌、抑制IL-2R（CD25）的表達和降低患者血清中sPD-1的表達水平有關(guān)。此研究發(fā)現(xiàn)為進一步理解再障的病因、治療和預(yù)后監(jiān)測提供了實驗基礎(chǔ)，為尋找免疫干預(yù)的新靶點提供了理論依據(jù)，