重型再生障礙性貧血調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量與功能異常的研究.pdf

1、目的：
　　研究重型再生障礙性貧血（Severe aplastic anemia，SAA）患者與正常人調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Tregs）數(shù)量及功能的差異；探索并建立體外細胞培養(yǎng)體系，驗證Treg細胞對其他免疫細胞數(shù)量與功能的影響，闡明在SAA發(fā)病過程中Treg細胞所扮演的角色，并為開發(fā)新的治療方法提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　研究對象為天津醫(yī)科大學總醫(yī)院自2014年1月至2016年1月收

2、治的SAA初治患者、治療后恢復(fù)期（包括完全緩解與部分緩解）患者及正常對照者。
　　第一部分采用流式細胞術(shù)檢測 SAA初治患者、SAA恢復(fù)期患者和正常對照者外周血CD4+ CD25+ CD127dim Treg細胞數(shù)量及功能分子T淋巴細胞毒性相關(guān)抗原4（Cytotoxic T lymphocyte antigen4，CTLA-4）、穿孔素（Perforin）、CD39、CD73、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白（glucoc

3、orticoid-induced TNFR-related protein，GITR）、T細胞活化銜接因子（linker for activation of T cells， LAT）的表達情況，并與臨床造血與免疫指標作相關(guān)性分析。
　　第二部分,免疫磁珠分選SAA患者和正常對照CD4+CD25+CD127dim Treg細胞及CD4+CD25-效應(yīng)T細胞（effective T cells，Teff），應(yīng)用CD3/CD28單抗包

4、被的磁珠加上高濃度IL-2刺激，體外培養(yǎng)Tregs，分組比較細胞增殖情況，ELISA檢測培養(yǎng)基上清IL-10水平。將SAA患者/正常對照的Treg/Teff細胞混合交叉培養(yǎng)，CCK-8檢測Teff細胞增殖，ELISA檢測培養(yǎng)基上清IFN-γ水平。
　　第三部分免疫磁珠分選SAA患者和正常對照Treg細胞，實時熒光定量PCR檢測CTLA-4 mRNA的表達情況；體外誘導(dǎo)SAA患者骨髓單個核細胞成為樹突狀細胞（DC），將其分別與SAA

5、患者、正常對照者的Treg細胞共培養(yǎng)，流式細胞術(shù)分析DC表面CD80、CD86的表達。
　　第四部分采用流式細胞術(shù)檢測SAA患者和正常對照Treg細胞腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand， TRAIL）蛋白的表達，免疫磁珠分選Treg細胞，實時熒光定量PCR檢測TRAIL mRNA的表達。
　　結(jié)果：
　　第一部分初

6、治組Tregs/CD4+T百分比為（2.94±0.65）％，較恢復(fù)組（4.07±1.17）％和正常對照組（4.98±1.38）％顯著降低（P<0.01）；初治組Treg絕對細胞數(shù)量與恢復(fù)組、正常對照組相比也顯著下降（P<0.01），完全緩解組與部分緩解組也有顯著差異（P<0.01）。初治組Treg細胞CTLA-4的表達率為（9.11±5.57）％，顯著低于正常對照組（15.00±8.30）％（P<0.05）；與Tregs百分比相乘后，初

7、治組（0.26±0.16）％和恢復(fù)組（0.34±0.19）％較正常對照組（0.64±0.34）％下降更為顯著（P<0.01）。初治組 Tregs穿孔素的表達率為（3.80±2.54）％，略高于正常對照組（1.88±1.55）％和恢復(fù)組（2.78±2.52）％；與Tregs/CD4+T%相乘后，初治組（0.10±0.06）％不再高于對照組（0.09±0.09）％。而 Tregs CD39、CD73和 GITR的表達率在三組之間均無明顯差異

8、；但與Tregs/CD4+T%相乘后，初治組均低于正常對照組。初治組、恢復(fù)組和正常對照組Tregs LAT表達率分別為（3.80±4.35）％，（2.77±3.41）％和（1.48±1.20）％；與Tregs百分比相乘后變?yōu)椋?.11±0.11）％、（0.10±0.10）％和（0.09±0.09）％。SAA患者Tregs/CD4+T%與中性粒細胞絕對值（r=0.533;P=0.000），血紅蛋白（r=0.337;P=0.024），血小板

9、計數(shù)（r=0.355;P=0.017），及網(wǎng)織紅細胞百分比（r=0.393;P=0.008）均呈正相關(guān)。
　　第二部分分選后的Treg和Teff細胞的純度均在90％以上。體外培養(yǎng)8天后，Treg細胞數(shù)量可擴增約10倍，且純度仍保持在約60％。細胞生長曲線顯示初治患者Tregs甚至比恢復(fù)組和正常對照的增殖能力更強。初治組、恢復(fù)組和正常對照組外周血/骨髓的Treg細胞增殖倍數(shù)分別為（17.54±10.34）/（9.21±8.54），（

10、8.05±5.67）/（11.29±18.28）和（6.14±8.80）/（3.71±2.84）。初治組、恢復(fù)組和正常對照組Treg細胞培養(yǎng)基上清液中IL-10的濃度分別為（27.82±35.92） pg/ml，（44.98±64.30）pg/ml和（50.94±65.91）pg/ml。交叉培養(yǎng)后，Teff細胞的增殖率在（正常對照Teff∶正常對照Treg），（正常對照Teff∶SAA Treg），（SAA Teff∶正常對照 Treg

11、）和（SAA Teff∶SAA Treg）分別為（1.89±0.49），（1.86±0.61），（1.94±0.64），（1.90±0.64），無統(tǒng)計學差異。四組的培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度按以上順序依次為（25.87±24.07）pg/ml，（21.89±18.65）pg/ml，（15.63±9.35）pg/ml，和（10.16±5.52）pg/ml，（正常對照Teff∶正常對照Treg）組顯著高于（SAA Teff∶SAA Treg）

12、組（P<0.05）。
　　第三部分初治組、恢復(fù)組和對照組Treg細胞內(nèi)CTLA-4 mRNA水平（2-ΔΔCt）分別為（1.32±1.05）、（1.00±1.46）和（1.73±1.42），其中恢復(fù)組顯著低于對照組（P＜0.05），初治組稍高于恢復(fù)組、低于對照組（P=0.48），趨勢與CTLA-4蛋白表達水平相一致。流式檢測SAA mDC單獨培養(yǎng)后CD80、CD86的表達率為20.43%、47.80%，SAA mDC∶SAA Tr

13、eg共培養(yǎng)后CD80、CD86的表達率為18.33%、43.93%，SAA mDC∶正常對照Treg共培養(yǎng)后CD80、CD86的表達率為19.59%、45.98%。
　　第四部分流式檢測初治組Treg細胞TRAIL的表達率為（23.83±12.19）％，有略高于恢復(fù)組（19.71±10.09）％和正常對照組（20.09±9.57）％的趨勢（P?0.05），后兩者之間沒有差異。PCR檢測Treg細胞內(nèi)TRAIL mRNA水平，初治組

14、、恢復(fù)組和對照組2-△△Ct分別為（44.07±81.56）、（108.51±253.19）和（15.50±36.23），趨勢與蛋白水平相一致。
　　結(jié)論：
　　1、SAA患者CD4+CD25+CD127dim Treg細胞數(shù)量顯著減少，無論是相對數(shù)量還是絕對數(shù)量，且與各項臨床病情指標呈顯著正相關(guān)，經(jīng)過強化免疫抑制治療（IST）可得到明顯改善。
　　2、SAA患者Treg細胞CTLA-4的表達顯著減少，表明CTLA-4

15、可能是SAA患者Treg異常的主要因素；穿孔素表達較高可能是一種代償，但由于Treg整體細胞數(shù)量不足，代償也不足。而CD39、CD73和GITR所介導(dǎo)的抑制機制、單個Treg細胞的存活能力、及LAT在Treg中所發(fā)揮的活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能可能并未受損。
　　3、SAA患者體內(nèi)的Treg細胞可被成功分離純化，且應(yīng)用CD3/CD28單抗的磁珠加高濃度IL-2可在體外成功擴增Treg細胞；SAA患者的Treg甚至具有比正常對照更強的增殖能