藍(lán)圓鲹蛋白制備抗氧化肽的研究.pdf

1、藍(lán)圓鲹(Decapterus maruadsi)屬于鱸形目鲹科圓鲹屬的一種,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一。對(duì)其加工利用制成魚糜罐頭制品或改性制備功能活性肽,則可大大提高其附加值。本文以藍(lán)圓鲹蛋白為原料,運(yùn)用酶解技術(shù)制備抗氧化肽,采用體外評(píng)價(jià)法測(cè)定其抗氧化活性,通過(guò)多種分離技術(shù)手段對(duì)藍(lán)圓鲹多肽進(jìn)行分級(jí)分離,并采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)肽段進(jìn)行一級(jí)氨基酸序列鑒定。新發(fā)現(xiàn)的肽段經(jīng)化學(xué)合成后,對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化活性驗(yàn)證及反應(yīng)動(dòng)力

2、學(xué)研究。最后研究了藍(lán)圓鲹多肽在加工儲(chǔ)藏過(guò)程中,及體外模擬胃腸消化道過(guò)程中的抗氧化活性穩(wěn)定性,并探討了藍(lán)圓鲹多肽與其他常見(jiàn)抗氧化劑的協(xié)同抗氧化效應(yīng)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)凱氏定氮法、索氏抽提法和OPA柱前衍生化高效液相色譜法分別測(cè)定藍(lán)圓鲹蛋白的基本組分含量。結(jié)果表明藍(lán)圓鲹是一種高蛋白(80.16％)、低脂肪(10.38%)、必需氨基酸含量(46.28g/100g protein)和抗氧化性氨基酸含量(32.59g/100

3、g protein)均較理想的食品原料。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用蛋白酶解技術(shù),以DPPH·清除活性、O2·清除活性及還原能力三種體外抗氧化能力為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶五種商業(yè)蛋白酶水解藍(lán)圓鲹蛋白。綜合比較后選擇堿性蛋白酶作為制備藍(lán)圓鲹蛋白抗氧化肽的最佳蛋白酶。
　　(2)以水解度為指標(biāo),分別采用單因素法和Box-Benhnken Design(BBD)響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶水解藍(lán)圓鲹蛋白的酶

4、解工藝條件,建立了水解度(Y)與初始底物濃度(S0,X1)、初始酶濃度(E0,X2)、pH(X3)、酶解溫度(T,X4)4個(gè)因素之間的二元回歸模型:Y=22.23-1.05X1+0.66X2+0.79X3+1.09X4-0.082X1X2+0.11X1X3+0.16X1X4-0.17X2X3-0.067X2X4-0.25X3X4-0.04X12-0.22X22-0.37X32-0.44X42。并根據(jù)此數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)化分析計(jì)算得到最

5、佳酶解條件:初始底物濃度16.3g·L1,初始酶濃度0.11g·L1,酶解溫度50.5℃,pH8.18,水解300min,理論上可達(dá)到22.2%的水解度值,與模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值22.4%接近。同時(shí),實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)圓鲹蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性、氨基酸組成及分子量分布均與水解度密切相關(guān)。水解度為23.0%的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性較高,與其產(chǎn)物中的抗氧化性氨基酸含量相對(duì)應(yīng)。
　　(3)堿性蛋白酶在45.0℃至65.0℃范圍內(nèi)的酶失活熱動(dòng)力學(xué)性

6、質(zhì)研究表明,堿性蛋白酶失活符合蛋白酶一級(jí)熱失活動(dòng)力學(xué)方程。在50.0℃、pH9.5的反應(yīng)條件下,堿性蛋白酶酶解藍(lán)圓鲹蛋白的米氏常數(shù)Km值為29.115g·L1。并建立了堿性蛋白酶可控酶解藍(lán)圓鲹蛋白的水解度動(dòng)力學(xué)模型為:DH=5.970×In[1+（34.869×Eo/So+0.045)×t],水解速率動(dòng)力學(xué)模型為:r=(208.1758Eo/So+0.2723)exp[-0.1675(DH)],實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明在一定程度上模型數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、吻合良好。
　　(4)采用超濾、凝膠層析、高效液相色譜等不同分離純化技術(shù)對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,得到抗氧化活性較好的兩個(gè)高親水性肽片段B11和B12。采用MALDI-TOF-TOF MS分析鑒定其氨基酸序列結(jié)構(gòu),得到B11、B12抗氧化肽氨基酸序列分別為His-Asp-His-Pro-Val-Cys(HDHPVC,707.11Da)和His-Glu-Lys-Val-Cys(HEKVC,615.22Da)。B11、B12經(jīng)

8、化學(xué)合成后,分別采用DPPH·清除法、O2·清除法及還原能力法三種體外抗氧化活性檢測(cè)法驗(yàn)證其抗氧化能力。結(jié)果表明兩個(gè)抗氧化肽均具有較強(qiáng)的抗氧化能力。
　　(5)對(duì)抗氧化肽HDHPVC和HEKVC清除DPPH·反應(yīng)進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果表明HDHPVC和HEKVC均屬于慢反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì),其在固定30min反應(yīng)時(shí)間條件下的EC50值(分別為31.0μM和67.7μM)比穩(wěn)態(tài)條件下的IC50值(分別為9.0μM和14.5μM)偏大3至5

9、倍。HDHPVC和HEKVC的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k2分別為2.00×105μM1·s1和0.70×105μM1·s1,表明HEKVC清除能力較差,而HDHPVC清除能力稍遜于對(duì)照物GSH（k2為2.30×105μM1·s1)。
　　(6)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,藍(lán)圓鲹多肽(RSH-III,Mw<5.0kDa)具有較好的耐熱性能;在pH≤7的酸、中性環(huán)境中活性保持較好,但不耐堿;藍(lán)圓鲹多肽經(jīng)體外胃腸道消化后仍能保持70%左右的抗氧化活性