灰飛虱NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶基因克隆及RNAi功能分析.pdf

1、灰飛虱Laodelphax striatellus(Fallén)是水稻和小麥等農(nóng)作物上的一種重要害蟲(chóng)，它的危害方式分為兩種:一是通過(guò)刺吸方式取食作物，造成組織損傷;二是攜帶病毒至水稻、小麥等作物上引發(fā)病毒病。21世紀(jì)之前灰飛虱在我國(guó)幾乎沒(méi)有發(fā)生，未引起農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的足夠重視，只是在防治褐飛虱（Nilaparvata lugens）與白背飛虱（Sogatella furcifera）的過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行協(xié)同兼治。近年來(lái)，灰飛虱在我國(guó)大部分稻區(qū)

2、特別是江蘇、安徽等地頻繁暴發(fā)。面對(duì)其大面積發(fā)生，人們主要通過(guò)化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。但由于農(nóng)藥的不合理使用，灰飛虱抗性得到不斷上升，灰飛虱頻繁大發(fā)生與其抗藥性的升高緊密相關(guān)。鑒于農(nóng)藥使用導(dǎo)致田間抗性水平不斷提高，以及過(guò)量使用農(nóng)藥帶來(lái)的一系列環(huán)境與社會(huì)問(wèn)題，開(kāi)辟害蟲(chóng)防控新途徑是當(dāng)今植物保護(hù)領(lǐng)域迫在眉睫的一項(xiàng)科研任務(wù)。鑒于此，本文首先克隆分析潛在的靶標(biāo)基因，探索目標(biāo)基因的沉默是否導(dǎo)致灰飛虱死亡，從而挖掘重要的靶標(biāo)基因，為利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)防控灰飛

3、虱提供重要的基因材料和方法啟示，為更好地進(jìn)行灰飛虱抗性治理和新藥開(kāi)發(fā)提供新的依據(jù)。
　　一、灰飛虱NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶基因全長(zhǎng)克隆及序列分析
　　首先通過(guò)簡(jiǎn)并引物獲得灰飛虱NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶（LSCPR）1550bp的基因片段，然后通過(guò)RACE技術(shù)成功獲得LSCPR基因全長(zhǎng)?；蚓幋a區(qū)全長(zhǎng)2040bp共編碼679個(gè)氨基酸，氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)LSCPR與其它已報(bào)道昆蟲(chóng)有較高的同源相似性，序列比對(duì)顯示與

4、褐飛虱（N.lugens）CPR有94％同源性、與溫帶臭蟲(chóng)（Cimexlectularius）CPR有75％同源性、與弓背蟻（Camponotus cylindricus）CPR有70％同源性，并且包含CPR基因所有的保守序列特征，其中主要包括膜錨定區(qū)(E15-W35)、黃素氧還蛋白區(qū)(81A-218W)、FAD結(jié)合區(qū)(273P-492W)、NADP結(jié)合區(qū)(531I-643N)、FAD結(jié)合核心保守位點(diǎn)(453-RYYS-456)、標(biāo)準(zhǔn)催

5、化殘基（456S、631C、676D和678W）、FMN1結(jié)合位點(diǎn)和FMN2結(jié)合位點(diǎn)。因此初步推斷該基因?yàn)長(zhǎng)SCPR基因。
　　二、灰飛虱NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶基因RNAi功能分析
　　以灰飛虱NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶（LSCPR）基因?yàn)榘袠?biāo)，通過(guò)T7 RiboMaxExpress RNAi System成功合成LSCPR雙鏈(338bp)，以外源熒光蛋白基因（GFP）為對(duì)照，分別采用不加任何雙鏈的人工