賴(lài)氨大黃酸的制備及其抗腫瘤作用機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是人類(lèi)健康的第二大殺手，在某些地區(qū)已上升為頭號(hào)殺手，世界每年死于惡性腫瘤的人數(shù)呈逐年遞增的趨勢(shì)。開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物將是人類(lèi)戰(zhàn)勝惡性腫瘤的重要手段之一。近年來(lái)，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)腫瘤形成過(guò)程中的受體、基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有了比較深入的了解，在此基礎(chǔ)上發(fā)展的靶向治療獲得了突破性的進(jìn)展，靶向藥物的研究是當(dāng)前臨床研究最活躍的領(lǐng)域之一，其中靶向蛋白酪氨酸激酶的藥物已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。蛋白酪氨酸激酶(PTKs)是一種能選擇性地使

2、不同底物的酪氨酸殘基磷酸化的一種酶，大致可分為受體酪氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶、IR和Janus激酶等。在病理?xiàng)l件下PTKs會(huì)持續(xù)活化，阻斷其對(duì)細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和凋亡等的調(diào)節(jié)功能，誘發(fā)腫瘤。 據(jù)報(bào)道受體PTKs家族中超過(guò)50％的成員發(fā)生與人類(lèi)惡性腫瘤相關(guān)的突變或者過(guò)度表達(dá)，其中30％的成員與人類(lèi)實(shí)體腫瘤相關(guān)。EGFR家族是受體PTKs中重要成員，其包括4個(gè)成員，分別是EGFR(ErbB-1，HER-1)、HER-2(ErbB-2)

3、、HER-3(ErbB-3)和HER-4(ErbB-4)。在全世界每年診斷的150萬(wàn)新增乳腺腫瘤患者中，27％-30％與EGFR的過(guò)度表達(dá)有關(guān)，20％-25％與HER-2的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。單純針對(duì)EGFR或者HER-2的單克隆抗體或蛋白酪氨酸激酶抑制劑(TKI)存在很大局限性，針對(duì)單靶點(diǎn)的藥物在腫瘤治療方面有效率不足30％，雖然與其它藥物聯(lián)用可以在一定程度上提高藥物療效，但是通過(guò)受體酪氨酸激酶活性的相互補(bǔ)充，很快產(chǎn)生耐藥。因此開(kāi)發(fā)針對(duì)EG

4、FR和HER-2雙靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑將會(huì)提高腫瘤治療的療效。蛋白酪氨酸激酶的抑制劑-大黃素能夠通過(guò)抑制HER-2的自身磷酸化和交互磷酸化，阻斷ErbB-2的酪氨酸激酶活性。對(duì)HER-2過(guò)度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞采用大黃素處理能夠降低酪氨酸的過(guò)度磷酸化，提高細(xì)胞對(duì)化療藥物紫杉醇的敏感性，本文研究同為大黃蒽醌類(lèi)化合物的大黃酸是否對(duì)EGFR和HER-2蛋白酪氨酸激酶活性起到雙重抑制作用。 大量文獻(xiàn)報(bào)道大黃中的三種葸醌類(lèi)化合物大黃酸、大黃

5、素和蘆薈大黃素能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管形成、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等多方面的抗腫瘤活性。但是由于其水溶性低，生物利用度差，目前除應(yīng)用其瀉下作用外，其它藥理活性還沒(méi)有應(yīng)用于臨床。大黃酸與大黃中其它葸醌類(lèi)化合物最顯著的區(qū)別就是大黃酸存在一個(gè)游離的羧基，因此我們選擇大黃酸的羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。 第一部分以增加水溶性為目標(biāo)的大黃酸衍生物制備 目的：通過(guò)對(duì)大黃酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，制備出水溶性好的大黃酸衍生物或其

6、鹽。 方法：方法一，在特定反應(yīng)條件下，通過(guò)大黃酸與賴(lài)氨酸反應(yīng)生成賴(lài)氨酰大黃酸，借助賴(lài)氨酸存在的游離氨基和羧基增加賴(lài)氨酰大黃酸在水中的溶解度。方法二，在一定反應(yīng)條件下，通過(guò)賴(lài)氨酸與大黃酸之間的酸堿反應(yīng)生成穩(wěn)定的鹽，增加大黃酸在水中的溶解度。通過(guò)MTT方法檢測(cè)產(chǎn)物的體外抗腫瘤活性。 結(jié)果：按照方法一獲得了黃色和紫紅色兩種產(chǎn)物，其中黃色產(chǎn)物不溶于水，紫紅色產(chǎn)物水溶性好，對(duì)兩種產(chǎn)物進(jìn)行了紅外光譜測(cè)定，證明兩種產(chǎn)物均為大黃酰賴(lài)氨酸

7、甲酯，應(yīng)用MTT方法檢測(cè)了這兩種產(chǎn)物體外抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)二者的體外抗腫瘤活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大黃酸，而且其產(chǎn)率也比較低，分別為6％和9％，因此沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步研究。按照方法二獲得了水溶性好的紫色產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)紫外分光光度法、HPLC法和紅外光譜法驗(yàn)證此產(chǎn)物為賴(lài)氨大黃酸鹽(RHL)，通過(guò)MTT方法證實(shí)RHL與大黃酸具有同等的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性。 結(jié)論：大黃酰賴(lài)氨酸甲酯雖然能夠部分改善大黃酸水溶性差的缺點(diǎn)，但是其體外抗腫瘤活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大黃酸，沒(méi)

8、有對(duì)其進(jìn)一步研究。RHL不僅解決了大黃酸水溶性難的問(wèn)題，而且其抗腫瘤活性與大黃酸相當(dāng)，有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藥物的潛力。 第二部分賴(lài)氨大黃酸體外抗腫瘤活性及分子機(jī)制研究 目的：觀察RHL體外抗腫瘤作用，探討其分子作用機(jī)制。 方法：通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖，Westernblot檢測(cè)受體PTKs通路蛋白表達(dá)水平及其磷酸化水平的變化，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)EGFR和HER-2蛋白表達(dá)水平變化，RT-PCR檢測(cè)HER-2在基因轉(zhuǎn)

9、錄水平上的變化，流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。 結(jié)果：RHL抑制不同來(lái)源的乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、SK-Br-3和MDA-MB-231)、卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞系和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖，IC50分別為95μmol/L、80μmol/L、110μmol/L、85μmol/L和200μmol/L。而且RHL在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面與大黃酸相近。對(duì)RHL抗腫瘤機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)：在EGFR高表達(dá)和HER-

10、2低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞，其通過(guò)抑制EGFR的磷酸化及其下游Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的磷酸化抑制細(xì)胞增殖，并且其與紫杉醇等其它化療藥物聯(lián)合發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用；在EGFR和HER-2高表達(dá)的SK-Br-3細(xì)胞，其能夠抑制EGFR和HER-2蛋白表達(dá)和蛋白磷酸化水平，并且能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞通過(guò)p53和p21途徑發(fā)生細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：RHL是新型的靶向EGFR和HER-2雙靶點(diǎn)的受體蛋白酪氨酸激酶抑制劑。通過(guò)抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞

11、凋亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。 第三部分賴(lài)氨大黃酸體內(nèi)抗腫瘤活性及其與紫杉醇的協(xié)同作用 目的：觀察RHL體內(nèi)抗腫瘤活性和探討其與紫杉醇協(xié)同抗腫瘤作用的機(jī)制。 方法：建立小鼠肝癌和人類(lèi)腫瘤裸鼠移植模型，分別采用灌胃、腹腔注射途徑給藥，觀察小鼠對(duì)藥物的耐受情況和藥物的抗腫瘤活性。并通過(guò)免疫組化方法觀察腫瘤組織EGFR蛋白磷酸化水平變化。 結(jié)果：RHL單獨(dú)用藥有一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用。采用腹腔注射方法給藥優(yōu)于灌胃給藥

12、。其與紫杉醇合用，在小鼠H22肝癌和MCF-7乳腺癌裸鼠移植瘤模型均表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。免疫組化研究結(jié)果表明RHL能夠抑制由紫杉醇引起的EGFR和ERK蛋白磷酸化水平升高。 結(jié)論：RHL體內(nèi)應(yīng)用抑制小鼠H22肝癌和人類(lèi)乳腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，腹腔注射途徑給藥比灌胃給藥有更高抑瘤率。在小鼠H22肝癌和人類(lèi)乳腺癌裸鼠移植瘤，RHL與Taxol聯(lián)合有協(xié)同抗腫瘤作用。 總結(jié)：本文通過(guò)對(duì)大黃酸的改造獲得了水溶性好的RHL。RHL抑