吡格列酮抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥性骨吸收作用的研究.pdf

1、【研究背景和目的】
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以外周關(guān)節(jié)慢性炎癥及滑膜增生為主要表現(xiàn),繼而發(fā)展為關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下的骨破壞的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。RA的軟骨和骨破壞造成的關(guān)節(jié)功能喪失不可逆轉(zhuǎn),給病人帶來(lái)極大的痛苦。因此,阻止軟骨及骨破壞在抗RA治療中至關(guān)重要。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)是現(xiàn)今國(guó)內(nèi)外最為廣泛接受的RA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?兩者具

2、有許多相似的病理生理特點(diǎn)——腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)等炎癥因子的明顯增高,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜增生,軟骨和骨破壞等。
　　OPG/RANKL/RANK是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)分化過(guò)程中的一個(gè)重要系統(tǒng)。核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor

3、-κB ligand,RANKL)也被稱為破骨細(xì)胞分化因子,其受體是位于OC前體細(xì)胞膜上的核因子-κB受體活化因子(Receptor activator for nuclear factor-κB,RANK);而骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,OPG)是RANKL的假受體,可與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK。活化T細(xì)胞或滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL,與RANK結(jié)合,可促進(jìn)OC前體細(xì)胞向OC分化和成熟,促進(jìn)骨破壞與吸收。因此,RA

4、NKL可促進(jìn)軟骨及骨的破壞和吸收,OPG可拮抗RANKL的作用。另外,TNFα和RANK/RANKL都可通過(guò)直接或者間接作用于信號(hào)通路中的NF-κB,通過(guò)一系列反應(yīng)最終介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化,所以TNFα也是造成炎癥性骨吸收的危險(xiǎn)因子。本研究檢測(cè)CIA大鼠的OPG、RANKL及TNFα的表達(dá)可準(zhǔn)確地反映其骨代謝狀況。
　　目前臨床上的改善病情抗風(fēng)濕藥的療效個(gè)體差異比較大,其所帶來(lái)的感染、肝功能損害等副作用也較多。因此開(kāi)發(fā)新的藥物、新的作

5、用靶點(diǎn)是勢(shì)在必行的。本課題研究的吡格列酮是一種過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)激動(dòng)劑,即臨床上的噻唑烷二酮類(thiazolidinediones,TZDs)降糖藥。長(zhǎng)期以來(lái),此類藥物被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松和骨折的危險(xiǎn)因素,但近年來(lái)研究表明其不僅具有抗關(guān)節(jié)炎癥作用,還具有抑制骨吸收作用[1,2],很有希望被應(yīng)用于治療炎癥性骨吸收疾病,

6、而對(duì)于治療RA合并血糖升高及骨吸收的患者則更為合適。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道已普遍認(rèn)為其具有一定抗關(guān)節(jié)炎作用,而對(duì)于其是否具有抑制骨吸收作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　基于以上的研究背景,本研究的目的在于:一是建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型——CIA,并動(dòng)態(tài)觀察CIA大鼠炎癥發(fā)展,以及OPG、RANKL、TNFα的表達(dá);二是驗(yàn)證PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮是否可抑制CIA大鼠的炎癥性骨吸收,為進(jìn)一步探討其抑制炎癥性骨吸收的作用機(jī)制做準(zhǔn)備。
　　

7、【內(nèi)容和方法】
　　第一部分:CIA大鼠模型的建立及其血清、關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中OPG、RANKL及TNFα的表達(dá)
　　用牛Ⅱ型膠原和不完全弗式佐劑混合液注入大鼠皮下以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥。觀察造模前后大鼠的活動(dòng)、精神、飲食、關(guān)節(jié)紅腫及大鼠后踝關(guān)節(jié)病理,每周記錄大鼠的體重及后踝關(guān)節(jié)體積變化,并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)法和免疫組化法(immunohistoche

8、mistry,IHC)檢測(cè)大鼠血清與關(guān)節(jié)滑膜中的TNFα蛋白的表達(dá)等以評(píng)估造模是否成功。用ELISA、IHC及免疫印跡(Western Blotting,WB)等方法檢測(cè)并比較模型組和正常組大鼠血清、關(guān)節(jié)軟骨及滑膜中的OPG的蛋白表達(dá);用IHC法檢測(cè)和比較模型組與正常組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中RANKL的蛋白表達(dá)。
　　第二部分:吡格列酮抑制CIA大鼠的炎癥性骨吸收
　　按第一部分的造模方法建立CIA大鼠模型。隨后分別用低、中、高劑量

9、(3、10、30mg/kg/d)的吡格列酮混懸液灌胃,用TNFα拮抗劑(TNFα拮抗劑,注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白)腹腔注射治療CIA大鼠3周。比較各治療組與正常對(duì)照組、模型對(duì)照組的病理差異、骨代謝指標(biāo)——OPG、RANKL及TNFα的蛋白水平差別。用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中OPG及TNFα的蛋白含量;用IHC法檢測(cè)各組大鼠后踝關(guān)節(jié)軟骨中OPG及RANKL、滑膜中TNFα的蛋白表達(dá);用WB法檢測(cè)各組大鼠后膝關(guān)節(jié)

10、滑膜中OPG蛋白的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　第一部分:CIA大鼠模型的建立及其血清、關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中OPG、RANKL及TNFα的表達(dá)
　　造模開(kāi)始后,相比同期的正常組大鼠,CIA大鼠的進(jìn)食、活動(dòng)減少,精神下降,體重減輕,關(guān)節(jié)腫脹持續(xù)存在;CIA大鼠血清和關(guān)節(jié)滑膜中TNFα蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.01),且滑膜中TNFα蛋白的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)有持續(xù)增加趨勢(shì)。CIA大鼠在造模后第14天,關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥、增生較明顯,滑

11、膜組織長(zhǎng)入關(guān)節(jié)腔,但關(guān)節(jié)腔軟骨未見(jiàn)破壞;由于炎癥持續(xù)作用,造模后的第35天,滑膜組織侵入關(guān)節(jié)腔軟骨,軟骨不同程度破壞。正常組始終無(wú)關(guān)節(jié)滑膜組織增生、炎癥,更無(wú)軟骨和骨損害。相比正常組大鼠,CIA大鼠血清和后膝關(guān)節(jié)滑膜中OPG含量顯著降低(P<0.01),并長(zhǎng)時(shí)間維持在較低水平;CIA大鼠后踝關(guān)節(jié)軟骨中RANKL蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01),并長(zhǎng)時(shí)間維持在較高水平。
　　第二部分:吡格列酮抑制CIA大鼠的炎癥性骨吸收
　

12、　模型對(duì)照組后踝關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)、滑膜組織增生及軟骨不同程度破壞;各治療組關(guān)節(jié)炎癥和滑膜增生不同程度改善,無(wú)軟骨及骨破壞。相比模型對(duì)照組,各治療組血清及軟骨中OPG水平明顯增高(P<0.05),而血清中TNFα及軟骨中RANKL水平明顯降低(P<0.05)。相比低劑量吡格列酮治療組,高劑量吡格列酮治療組大鼠關(guān)節(jié)軟骨及滑膜中OPG水平明顯升高(P<0.05),而TNFα及RANKL水平明顯降低(P<0.05)。相比TNFα拮抗劑治療組,高

13、劑量吡格列酮治療組后踝關(guān)節(jié)軟骨中OPG水平較高(P<0.05),而RANKL水平較低(P<0.05)。
　　【結(jié)論】
　　1、成功建立了CIA大鼠模型,且CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥隨時(shí)間延長(zhǎng)有加重趨勢(shì)。CIA大鼠中RANKL及TNFα的表達(dá)上調(diào)、OPG的表達(dá)下調(diào)可能共同導(dǎo)致了炎癥性骨吸收。
　　2、吡格列酮可通過(guò)下調(diào)CIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中的RANKL及血清中的TNFα,通過(guò)上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨、滑膜及血清中OPG的蛋白表達(dá),起到一定的