經(jīng)鼻靶向中樞導(dǎo)入rhG-CSF對腦梗死大鼠的治療作用及機(jī)理.pdf

1、研究目的： 1.探討經(jīng)鼻靶向中樞導(dǎo)入重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)對腦梗死大鼠行為和神經(jīng)功能障礙的改善作用。 2.經(jīng)鼻靶向中樞導(dǎo)入人重組粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)對腦梗死大鼠FasL和HO-1表達(dá)的影響。 3.研究rhG-CSF經(jīng)鼻靶向中樞給藥對腦梗死大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化及其可塑性的影響。 4.觀察經(jīng)鼻導(dǎo)入rhG-CSF對腦梗死大鼠缺血半暗帶皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度

2、([Ca2+]i)及骨架蛋白α-tubulin的影響。 研究方法： 1.線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型，缺血2h再灌注。將動(dòng)物分為正常組、假手術(shù)對照組、腦梗死組、腦梗死+皮下注射rhG-CSF組、腦梗死+經(jīng)鼻生理鹽水組、腦梗死+經(jīng)鼻rhG-CSF組。于術(shù)前及缺血再灌注后1d、3d、7d、14d觀察動(dòng)物行為學(xué)變化，并進(jìn)行神經(jīng)功能評分。 2.采用線栓法制作大鼠可逆性大腦中動(dòng)脈阻塞模型(MCAO，2h后再灌注)。將6

3、0只動(dòng)物隨機(jī)分為正常組(n=6)、假手術(shù)對照組(n=6)、腦梗死組(n=12)、腦梗死+皮下注射rhG-CSF組(n=12)、腦梗死+經(jīng)鼻生理鹽水組(n=12)、腦梗死+經(jīng)鼻rhG-CSF組(n=12)。于誘導(dǎo)MCAO后1d、3d固定取材，制備腦組織冠狀冰凍切片，用免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測凋亡蛋白配體(FasL)與血紅素氧合酶-1(HO-1)在腦內(nèi)的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像采集，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。 3.運(yùn)用BrdU標(biāo)記法檢測腦局

4、灶梗死大鼠缺血半暗帶皮層、側(cè)腦室下區(qū)(SVZ)與海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層下區(qū)(SGZ)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況，運(yùn)用熒光雙標(biāo)法檢測BrdU+/GFAP+、BrdU+/NeuN+、BrdU+/PSA-NCAM+在腦內(nèi)的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像采集，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，確定其分化方向及可塑性。 4.采用線栓法制作MCAO模型(2h后再灌注)。將36只動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)對照組、腦梗死組、腦梗死+皮下注射rhG-CSF組、腦梗死+經(jīng)鼻生

5、理鹽水組、腦梗死+經(jīng)鼻rhG-CSF組，n=6。于誘導(dǎo)MCAO后1d處死，取梗死側(cè)額頂葉背外側(cè)皮層制備腦單細(xì)胞懸液，免疫組織化學(xué)方法借助激光共聚焦與流式細(xì)胞儀檢測缺血半暗帶皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)[ca2+]i、α-tubulin的熒光密度。 研究結(jié)果： 1.除正常組、假手術(shù)對照組外，其余各組動(dòng)物于術(shù)后出現(xiàn)異常行為改變和神經(jīng)功能障礙，尤以腦梗死組、經(jīng)鼻NS組最為明顯，二者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；皮下rhG-CSF組明顯改善，經(jīng)鼻

6、rhG-CSF組較皮下組改善更加顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.正常組、假手術(shù)組腦組織中FasL蛋白和HO-1陽性神經(jīng)細(xì)胞見極少量表達(dá)；腦梗死組大鼠FasL蛋白和HO-1的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，1d組>3d組。表達(dá)區(qū)域主要為灶周皮質(zhì)(paramedian cortex)和同側(cè)海馬：腦梗死組及腦梗死+經(jīng)鼻生理鹽水組FasL和HO-1的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhG-CSF治療后FasL，蛋白表達(dá)下降，而HO-1表達(dá)上調(diào)；在同一

7、時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)鼻rhG-CSF組FasL蛋白表達(dá)低于皮下注射rhG-CSF組，而HO-1表達(dá)前組高于后組。 3.正常組及假手術(shù)組大鼠腦內(nèi)存在少量BrdU陽性細(xì)胞。經(jīng)鼻給予rhG-CSF組大鼠腦內(nèi)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，鼻腔給予rhG-CSF組>皮下給予rhG-CSF組>腦梗死組。在SVZ和SGZ區(qū)域，7d組高于14d組；在缺血半暗帶皮層，14d組高于7d組。除脈絡(luò)叢外，經(jīng)鼻給予rhG-CSF組大鼠腦內(nèi)各部位均有BrdU+/GFA

8、P+表達(dá)。各表達(dá)區(qū)域的BrdU+/GFAP+細(xì)胞數(shù)于再灌注后7d表達(dá)明顯增高，鼻腔給予rhG-CSF組>皮下給予rhG-CSF組>腦梗死組，14d略有下降，降幅：鼻腔給予rhG-CSF組>皮下給予rhG-CSF組>腦梗死組。經(jīng)鼻給予rhG-CSF后腦梗死大鼠腦內(nèi)BrdU+/NeuN+和BrdU+/PSA-NCAM+細(xì)胞數(shù)也明顯增加。在各時(shí)間段及各表達(dá)部位，不同分組之間BrdU+/NeuN+和BrdU+/PSA-NCAM+的表達(dá)順序：鼻腔

9、給予rhG-CSF組>皮下給予rhG-CSF組>腦梗死組。 4.假手術(shù)對照組與正常組比較，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i、α-tubulin無變化；腦梗死后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i明顯升高，升高幅度：腦梗死組>皮下注射rhG-CSF組>經(jīng)鼻rhG-CSF組：α-tubulin表達(dá)降低，降低幅度經(jīng)鼻生理鹽水組>皮下注射rhG-CSF組>經(jīng)鼻rhG-CSF組。 研究結(jié)論： 1.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)能改善

10、局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能障礙，鼻腔給藥比皮下給藥療效更顯著。 2.經(jīng)鼻應(yīng)用rhG-CSF可以使凋亡蛋白配體FasL表達(dá)下降，HO-1表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)揮對缺血性腦組織的保護(hù)作用。 3.rhG-CSF經(jīng)鼻靶向中樞給藥可以促進(jìn)腦梗死后大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)其可塑性。 4.經(jīng)鼻導(dǎo)入rhG-CSF可以比皮下給藥更明顯地抑制腦梗死大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元胞內(nèi)[ca2+]i的升高，減少α-微管蛋白(α-tubul