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1、背景:心臟移植是一種用于治療嚴(yán)重冠心病等終末期心臟病患者的有效的外科手段,成功的器官保存是心臟移植手術(shù)成功的必要前提。然而,目前臨床上心臟的低溫保存時(shí)間局限在4至6h以?xún)?nèi),這與其它器官如肝、腎、胰的保存時(shí)間相比要短的多。如何有效地延長(zhǎng)供心的保存時(shí)間是當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)在Celsior心臟保存液中添加二氮嗪,能促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)低溫保存后心功能的恢復(fù)并減少心肌細(xì)胞凋亡。熱休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp
2、90)是一類(lèi)高度保守的蛋白質(zhì)家族的成員之一。Hsp90表達(dá)增加可誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用,其機(jī)制被認(rèn)為與其抗凋亡作用相關(guān)。然而,Hsp90是否參與了二氮嗪對(duì)抗低溫保存誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用尚不明了。
目的:研究Hsp90是否參與了二氮嗪對(duì)抗低溫保存誘導(dǎo)的心功能下降,同時(shí)探究其可能機(jī)制。
方法:(1)低溫保存模型的建立及心功能測(cè)定:離體大鼠心臟于Langendorff恒壓灌注裝置上平衡后,經(jīng)主動(dòng)脈根部灌注40C的Celsior
3、’心麻痹液,灌注時(shí)間控制在3min以?xún)?nèi),心臟表面同時(shí)降溫,待心臟停跳后分別置于不同成分的心麻痹液中(4℃)保存,3、6、或9h后心臟被重新置于Langendorff裝置上再灌注60min。灌注條件同保存前保持一致。通過(guò)MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)觀察左心室發(fā)展壓(LVDP)。
(2)細(xì)胞凋亡測(cè)定:取復(fù)灌末期大鼠左心室心尖部分,用TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡情況。計(jì)算陽(yáng)性凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比即為細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptos
4、is index,AI)。
(3)Bid表達(dá):取復(fù)灌末期大鼠心臟左心室心尖部分,勻漿提蛋白,用Western Blot來(lái)檢測(cè)Bid和tBid蛋白表達(dá)情況。
(4)Hsp90表達(dá):取復(fù)灌末期大鼠心臟左心室心尖部分,用RT-PCR檢測(cè)Hsp90mRNA水平,用Western Blot來(lái)檢測(cè)Hsp90蛋白質(zhì)水平。
結(jié)果:(1)心臟于單純Celsior保存液中低溫保存3-9 h后,于復(fù)灌60 min末測(cè)得各組心臟L
5、VDP’恢復(fù)率隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。而與單純Celsior保存液組相比,心臟在添加了二氮嗪(30μtM)的保存液中保存9h后LVDP’恢復(fù)率顯著增高,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降。
(2)心臟于單純Celsior保存液中低溫保存3h后,Bid蛋白表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異,且無(wú)明顯裂解。低溫保存6h或9h后,Bid裂解后產(chǎn)生的tBid(truncated Bid)片段量顯著增加;
6、然而,在心臟保存液中添加二氮嗪后,Bid裂解明顯受抑制。
(3)與對(duì)照組相比,心臟于Celsior液低溫保存3h,Hsp90 mRNA與蛋白表達(dá)水平均明顯增加。但隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)至6-9 h,Hsp90 mRNA與蛋白表達(dá)水平卻逐漸降低。與9h單純保存液組相比,二氮嗪組心臟Hsp90 mRNA與蛋白表達(dá)水平均顯著提高。
(4)17-AAG可部分取消二氮嗪增加低溫保存心臟LVDP恢復(fù)率的作用。此外,與二氮嗪組相比,保存
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