節(jié)桿菌黃嘌呤氧化酶的發(fā)酵、純化、特性及基因研究.pdf

1、黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，EC1.2.3.22)是嘌呤代謝途徑的關(guān)鍵酶，廣泛分布于各種生物體的組織和細(xì)胞中，主要催化次黃嘌呤氧化生成黃嘌呤，進(jìn)一步氧化黃嘌呤生成尿酸。臨床上可用于制備免疫抗體、腫瘤抑制劑和細(xì)胞缺血性再灌注損傷等疾病的檢測。 根據(jù)辣根過氧化物酶和黃嘌呤氧化酶的催化反應(yīng)特性，本文提出了以偶聯(lián)辣根過氧化物酶—苯酚—4—氨基安替比林反應(yīng)顯色，檢測黃嘌呤氧化酶活力的新方法。最佳測定條件為：辣根過氧化物酶

2、7000U·L-1，4—氨基安替比林1mmol·L-1，苯酚6mmol·L-1，黃嘌呤1mmol·L-1溶于50mmol·L-1TriS-HCL緩沖液(pH8.4)：反應(yīng)溫度為37℃，保溫時(shí)間為20min；檢測波長為508nm。本方法測定XOD酶活的線性范圍為5.0～100.0U·L-1，線性關(guān)系良好(r=0.9992)，檢出限為1.3U·L-1。 以黃嘌呤為唯一碳氮源，采用富集分離培養(yǎng)方法，在國內(nèi)首次篩選獲得一株產(chǎn)黃嘌呤氧化酶

3、細(xì)菌。經(jīng)生理生化鑒定和16SrDNA序列同源分析，確定其屬于微球菌科節(jié)桿菌屬，命名為Arthrobactersp.XL26，GenBank接受號為EF532600。此菌在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵基本培養(yǎng)基中的生長情況表明，達(dá)到最高菌體生長量的培養(yǎng)時(shí)間分別為24h和42h，發(fā)酵培養(yǎng)45h可達(dá)最高產(chǎn)酶活力，表明該菌發(fā)酵合成黃嘌呤氧化酶基本屬于生長偶聯(lián)型。 通過單因素掃描、Plackett—Burman、Box—Benken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分

4、析法優(yōu)化了產(chǎn)酶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成。最適發(fā)酵條件為：初始培養(yǎng)基pH8.5，培養(yǎng)溫度32℃，接種量10％，搖瓶培養(yǎng)基裝液比例30％，轉(zhuǎn)速210r·min-1；最適培養(yǎng)基組成為(g·L-1)。乳糖：葡萄糖(3：1)12.0，(NH4)2SO44.0，酵母粉2.13，黃嘌呤2.57，F(xiàn)eS04·7H2O0.5×10-3，MgSO4·7H2O0.2×10-3，CaCl25.33×10-3，KH2PO40.94，Na2HPO45.92。優(yōu)化后每升

5、發(fā)酵液產(chǎn)XOD可達(dá)409.6U，而且比酶活比初始基本發(fā)酵提高了15倍。進(jìn)一步采用間歇補(bǔ)料，產(chǎn)酶量又增加了35％。 經(jīng)過超聲破碎、硫酸銨分級鹽析、PEG6000/(NH4)2SO4雙水相萃取、Butyl—Sepharose4B疏水層析、DEAESepharoseCl-6BFF離子交換、PhenylSepharoseCl-4B疏水層析和SephacrylS-200HR凝膠過濾，從Arthrobactersp.XL26中分離得到黃嘌呤

6、氧化酶，其比酶活提高了270倍，達(dá)24U·mg-1，回收率為11％。SDS-PAGE確定此蛋白含有兩個(gè)大小不等的亞基，相對分子量分別約為55.48kDa和85.67kDa。推斷該酶為兩個(gè)不同亞基構(gòu)成的二聚體分子(α2β2)。 酶學(xué)性質(zhì)研究表明，來源于Arthrobactersp.XL26的黃嘌呤氧化酶最適反應(yīng)pH為8.0，最適溫度為55℃；在pH7.0～9.0TriS-HCI緩沖液中于25℃保溫16h，剩余相對酶活高于80％；在

7、35℃以下保溫30min，酶活保持100％。以黃嘌呤和次黃嘌呤為底物的表觀米氏常數(shù)分別為0.032mmol·L-1和0.133mmol·L-1。金屬離子Cu2+和pb2+對XOD有強(qiáng)烈的抑制作用，Ag+和Hg2+完全抑制了酶活性；而Mn2+、Co2+和Ba2+對XOD的酶活性略有激活作用?；瘜W(xué)物質(zhì)中水楊酸鈉、組胺、酒石酸鉀鈉、甘露醇、丙三醇、二硫蘇糖醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)6000及表面活性劑TritonX-11

8、4對XOD酶均為XOD的激活劑，可顯著提高酶反應(yīng)的速率；疊氮鈉和尿素可強(qiáng)烈抑制XOD酶活性；山梨醇和甘氨酸可以極大地提高酶熱穩(wěn)定作用。 根據(jù)GenBank、EMBt.和SWISS-PROT報(bào)導(dǎo)的黃嘌呤氧化酶蛋白保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物，以Arthrobactersp.XL26基因組為模板，采用簡并PCR、反向PCR和巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得編碼黃嘌呤氧化酶A、B亞基基因的全長序列分別為1542bp和2355bp，Genbank上的登

9、錄號分別為EF648005和EF648204，推測其各編碼513個(gè)氨基酸殘基的A亞基肽鏈和784個(gè)氨基酸殘基的B亞基肽鏈。同源性比對顯示，xodA和xodB推導(dǎo)的氨基酸序列分別與來源于AcinetobacterbaumanniiATCC17978的黃嘌呤脫氫酶小亞基和大亞基同源性達(dá)到了92％和84％。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在線分析表明，Arthrobactersp.XL26黃嘌呤氧化酶的A、B亞基均屬于(α＋β)型蛋白，其中[2Fe-2S]結(jié)合位點(diǎn)