乳源黃嘌呤脫氫酶和黃嘌呤氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)研究概述

1、安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ， J o u r n a lo f A n h u iA g r i ．S c i ． 2 0 1 5 ， 4 3 ( 4 ) ： 1 — 4責(zé)任編輯 劉月娟 責(zé)任校對 李巖 乳 源 黃 嘌 呤脫 氫 酶和 黃嘌 呤 氧化 酶 的 晶體 結(jié) 構(gòu) 研 究概 述 郭 曉 蕾， 施斌， 張婷( 無 限 極 ( 中 國 ) 有 限 公 司 ， F - ~ , F - , h l5 1 0 6 4 1 )摘要 在全球范圍內(nèi)， 高尿

2、酸血癥近年來發(fā)病率逐漸提高。黃嘌呤脫氫酶( X D H ) 、 黃嘌呤氧化酶( X O) 等是參與痛風(fēng)發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵 酶， 是開發(fā)抗痛風(fēng)藥物的重要靶標(biāo)。通過抑制嘌呤代謝關(guān)鍵酶活性 ， 可有效降低血漿尿酸水平。本文主要概述了在 2 ． 1 一 A分辨率下牛 乳來 源的二聚 x D H 的晶體結(jié) 構(gòu)及 在 2 ． 5 一 A分辨率 下 X O的晶體 結(jié)構(gòu) ， 發(fā)現(xiàn)每 個分子 由一個含 兩鐵硫 中心的氨基 端 2 0k D a 域 、 一

3、 個 中央 4 0k D a 黃素腺嘌呤二核苷酸域和一個 8 5k D a 鉬喋呤結(jié)合域。此外 ， 對黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶的主要變化歷程進(jìn)行概述。關(guān)鍵詞 黃嘌呤 脫 氫酶 ； 黃嘌呤氧 化酶 ； 晶體 結(jié)構(gòu) 中圖分 類號 S 1 8 8 ； T S 2 0 2 ． 3文獻(xiàn)標(biāo)識 碼 A文章編號 0 5 1 7 — 6 6 1 1 ( 2 0 1 5 ) 0 4 — 0 0 1 — 0 4 S t u d yo nXa n t h

4、 i n eDe h y d r o g e n a s ea n dXa n t h i n e0x i d a s eS t r u c t u r ef r o m Da i r yGU 0X i a o - l e i ， S H IB i n ， z H A N GT i n g( R & DI n f i n i t u s( C h i n a )L t d ， G u a n g z h o u ， G u a

5、 n g d o n g5 1 0 6 4 1 )A b s t r a c tR e c g n ty e a r s ． h y p e r u r i e e m i ah a sb e c a m em o r ea n dm o r ep o p u l a rw o r l d w i d e l y ． X a n t h i n ed e h y d r o g e n a s e( X D H)a n dx a n t

6、 b i n eo x i —d a s e( X O)a r et w ok e ye n z y m e st h a tp a r t i c i p a t et h eo c c u r r e n c ea n dt h ed e v e l o p m e n to fg o u t ， w h i c ha r ev e r yi m p o r t a n tt a r g e t sf o rg o u tt h e

7、 r a —p y ．B vi n h i b i t i n gt h o s ee n z y mea c t i v i t i e s ，t h eu r i ca c i dl e v e li nb l o o dp l a s mac o u l db ed e c r e a s e d ．T h ec r y s t a ls t r u c t u r eo ft h ed i me r i c( Mr ，2 9 0

8、． 0 0 0)b o v i n emi l kX DHa t2 ． 1 ． Ar e s o l u t i o na n dX Oa t 2 ． 5 一 Ar e s o l u t i o nw e r ep r e s e n t e d ．B e s i d e s ，t h ema j o rc h a n g e st h a tO c c u ro nt h ep r o t e o l y t i ct r a n

9、 s f or ma t i o no fX DHt ot h eX 0f o 1 T nwe r ed e s c r i b e da sw e l 1 ．Ke ywo r d sXa n t h i n ed e h y d r o g e n a s e： Xa n t h i n eo x i d a s e ；S t r u c t u r ea n a l y s i s乳源黃嘌呤氧化酶是一種典型的酶， 最初被認(rèn)為是一 種

10、醛氧化 酶 ， 后 來充 當(dāng)了整個復(fù) 雜金屬 黃素 蛋 白質(zhì) 類 的基準(zhǔn) 物 。黃嘌呤氧 化還原 酶可 從各 種 各樣 的生 物 ( 微生 物 、 人 等 ) 中分 離獲得 。它能廣泛 地催化 嘌呤 、 嘧 啶、 喋 呤和醛 類 的羥基化反應(yīng) J 。催 化 次 黃 嘌呤 和 黃 嘌呤 羥 基化 的哺乳 動 物酶， 即作用在尿酸形成的最后 2個步驟 ， 可以合成脫氫形 式 的黃嘌 呤脫 氫 酶 ( X D H) ， 并 且 在 細(xì)胞 主

11、要 以 這種 形 式 存 在 ， 但很容易被含巰基殘留物氧化或發(fā)生水解作用， 而轉(zhuǎn)化 為氧化形式 的黃嘌呤氧化酶( X O) 。X D H在黃素腺 嘌呤二 核苷 酸 ( F A D ) 反 應(yīng) 區(qū)域 ， 催 化 反 應(yīng) 向 N A D減 少 的 方 向進(jìn) 行 ， 然而 X O不 與 N A D反 應(yīng) ， 就 只能 將 分 子 氧作 為 反 應(yīng) 底 物 ， 生成超 氧化物 陰離子和過 氧化氫 。黃嘌 呤氧化 還原 酶 類是一種針對痛風(fēng)和高

12、尿酸血癥的藥物 ， 可將 X D H轉(zhuǎn)化成 X O ， 因其涉及 氧 自由基 誘發(fā)組 織損 傷類 型疾病 ( 如缺 血后 再 灌注損傷等) 已受到廣泛關(guān)注。最近研究表明， X O還可能具 有降 血壓 的作用 。黃嘌呤氧化還原酶類的活化 型是分子 質(zhì)量達(dá) 2 9 0k D a 的 同型二聚體。每個單體在反應(yīng) 中發(fā)揮著各 自的催化作 用。每個亞基有 1 個鉬喋呤輔 因子、 2 個不同光譜 [ 2 F e 一 2 S ] 中心 和 1 個 F

13、 A D輔 因子 。黃嘌呤 的氧化發(fā) 生在鉬 喋 呤 中心 ( M o -p t ) ， 電子進(jìn) 而 通過 分 子 內(nèi) 電子 轉(zhuǎn)移 迅 速 分 配 到 其 他 中 心。與其 他羥化 酶不 同 的是 ， X D H最 終用 一 個 水分 子 作 為氧 原 子來 源并入產(chǎn) 物 中。來 自 各 種來源 的黃 嘌呤 氧化 還原 酶類 的氨基 酸序 列 已 通過單 獨(dú)反 向轉(zhuǎn)錄 D N A ( c D N A s ) 或 基 因工 程推 導(dǎo) 出來

14、 。這 些酶類 約 由 13 3 0 個 氨基酸組 成 ， 而且 高度 同源 ， 例如牛奶 酶 類 ( 13 3 2 個 殘基 ) 中 9 0 ％ 的氨基 酸序列與人 類肝臟酶 ( 13 3 3個殘基 ) 具有 同一性 - 6 ] 。哺乳動物 的 X D H 用胰 蛋 白酶 限 制性蛋 白水解作 用后 ， 可得到 3 個 片段 ( 分子 量分別為 2 O 、 4 | D和 8 5k D a ) ， 與此同時 自身將轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶。序

15、列經(jīng) 對 比后 表明 ， 2 個 鐵硫 中心位 于在 N端 2 0k D a 片段 ， 黃素腺 嘌呤二核甘酸( F A D ) 位于中間 4 0k D a 片段， 而鉬中心位于 C端 的 8 5k D a 片段 。表 1收集到和修正的統(tǒng)計數(shù)據(jù) 注 ： R ? =F一 FI ／ F， F 。和 F是觀察 和計算的結(jié)構(gòu)系數(shù) ， 反射總和也相應(yīng)地用 于優(yōu)化模 型。X O晶體可以從牛奶的酶類中提純出來， 但提取的量并 不足 以用 作更深入 的

16、分析 。 由于缺 乏對黃 嘌呤氧 化還原 酶 2種形式 中任意一種 的結(jié)構(gòu) 信息 ， 這類 酶 的結(jié) 構(gòu) 一 機(jī)制 相關(guān) 性 作者簡 介 郭曉蕾( 1 9 7 5一) ， 女 ， 遼 寧鐵 嶺人 ， 中級 工程師 ， 碩 士 ， 從 事保 健食 品開發(fā) 。收稿 日期 2 0 1 4 - 1 2 — 1 7研究僅通過遠(yuǎn)親酶類推斷出來， 如來 自巨大脫硫孤菌屬的醛 氧化 酶( A L O， 2 3 ％ F e S - 和 M o — p t

17、 域 同一性 ； 醛氧 化酶 缺 乏黃 素輔 因子域 ) 和來 自 食羧 假單胞 菌 的一氧化碳 脫 氫酶 ( C O D ，1 7 ％的 S 、 M和亞基 具 同一 性)。盡 管這種 方法 為反應(yīng) 機(jī) 理提供 良好的模型， 特別是鉬喋呤亞位點(diǎn) ， 但幾乎沒有關(guān) 于 F A D位點(diǎn)的相關(guān)信息。顯然， 現(xiàn)在僅通過觀察包括人類和 4 3 卷 4 期 郭曉蕾等 乳源黃嘌呤脫氫酶和黃嘌呤氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)研 究概述 3時 ， P h e1

18、0 0 9的苯基 環(huán)通過最 近距離 為 3 ． 7A的通道 ， 與水 楊 酸 環(huán) 中心發(fā) 生交互 側(cè)立 ?；?于 以上研 究結(jié)果 ， 可 以建立 二環(huán) 底物結(jié)合模型， 例如有垂直于黃嘌呤六元環(huán)的 P h e1 0 0 9 ， 還有 位于底物五元環(huán)頂上的能與其中一個鉬配體形成共價鍵的 P h e9 1 4 疊 加平 面 ?；钚?部 位有 幾 個 有序 排 列 的水 分 子 ， 但 由于有水楊酸和氧化性輔因子的存在， 還不能確定具體是由哪個

19、水 分子提供 氧原 子 ， 進(jìn) 而并 入產(chǎn)物 中。2 ． 2 鐵／ 硫 域 X D H 的 N端域 包 含 2 個 結(jié) 構(gòu)排 列非 常類 似 于 D ． g i g a sA L O7 j 和 O ．c a r b o x i d o v o r a n sC O D中鐵 硫 域 的 F e ／ S綁定簇子域。N端子域有一個 [ 2 F e 一 2 S ] 簇。它能協(xié)調(diào) 至 C y s4 3 、 C y s4 8 、 C y s5 1

20、、 C y s7 3 ， 并且 位 于 接 近核 黃 素 環(huán) 的 7， 8一甲基 團(tuán)j 。c端子 域則 有一 個 四螺 旋束 ， 其簇 能在 M o — p t 活性部位協(xié) 調(diào)至 C y s1 1 3 、 C y s1 1 6 、 C y s1 4 8 和 C y s l 5 0 。根據(jù)各 自 不 同的電子順磁共振信號 ( E P R ) ， 分別指定兩 個簇 為 F e ／ SI 和 F e ／ SI I 。F e ／ SI 的信 號

21、與 菠菜 鐵 氧還 蛋 白中的相似 ， 而且 在溫度達(dá) 到 4 0K時易 觀察 到 。然而 ， 另 一個 F e ／ SI I 的信 號大體 上是更大 片的線條 ， 而且 只可在低 于 2 2K時觀察得 到 j 。這 2個 簇 的氧 化 還 原 勢 也 不 同 于在 一 2 3 5m V下測 得 F e ／ SI I 的氧化還原 勢和在 一 3 1 0m V2 5o C 下測得 F e ／ SI 的氧化還原勢 。至于大鼠肝酶， 這 2

22、 個 E P R信號通 過定 點(diǎn)誘 變分 配 給各 自的排列 基 序 。綁 定 到非 一 般 c端 簇 一 C y s — X a a 2一C y s 一 ／ ／一C y s —X a a l—C y s 一 的 圖形 顯 示 了 F e ／ SI 信號 ， 而 F e ／ SI I 信號是屬于 N端簇 的 。通過結(jié)合 電子順 磁 共 振 測 量 和 晶體 研 究 成 果 ， 可 了解 C O D 的 等 價 分配 。有趣的是 ， 替換

23、的 C y s4 3 可 以通過絲氨酸作 為 F e ／ SI I中心的一個鐵原子配位體 ， 導(dǎo)致它的 E P R譜和氧化還原勢發(fā) 生變化 。與此相反 ， C y s5 1 位的類似突變卻對另一個鐵原 子 配體 的特性無 明顯 影 響。 晶體 結(jié)構(gòu) 顯 示 了鐵 a與核 黃 素 70 【 甲基 的碳原子有 7 ． 8A的距離 。與 最近 F e ／ SI 的鐵 原子 有 1 2 ． 4A的距 離 。這 兩段間距 明顯 要 比 C y s

24、5 1 配體 鐵原子 b間距 、 F A D或 F e ／ SI 輔 因子 中的最近原 子間距 ( 分別為8 ． 1和 1 4 ． 1A ) 小得多 。鉬鐵 間距 和 F e ／ sI 簇最 短鐵原 子間距是 1 4 ． 7A ， 確立了基于 2 個順磁中心間的計算估計量為 l 4A 。根據(jù) 上述幾何 分布及 中心 的氧化 還原 勢 ， 電子從 鉬 原 子 到 2個 F e ／ S 中心 的 轉(zhuǎn) 移是 一 個 熱 力 學(xué)有 利 的變 化

25、 過 程 。除 M o ． p t 和 F e ／ sI 的相 互作用 ( M o — p t 的 2個 氨基取 代基和 C y s l 5 0的 s之 間的范德華 力 ) ， 明顯沒 有連接 其他 輔 因子的 “ 貫穿 綁定 ” 通 道 。既 然 它們 的 間距 比 l 4A要 小 ， 那 么 隧道 效應(yīng)是最 可能 的電子運(yùn)輸 機(jī)制 。2 ． 3F A D域 F A D域 是黃素 蛋 白家 族 的遠(yuǎn)親 ， 還 包含香 草 基醇氧化

26、酶 ( V A O ) 和 U D P - N一乙?；?烯 醇式 丙酮 酸 葡萄 糖 胺還原酶 ( M u r B ) 。M u r B是一種參與細(xì)菌細(xì)胞壁生物合成 的酶 。C O D的 F A D綁定亞基 M是該家族另一個成員。將 X D H 的 F A D域 和 C O D進(jìn) 行 比較 后 ， 發(fā) 現(xiàn) 當(dāng)該 域 被分 成 2個子域后 與 X D H中的殘基 4 1 3和 C O D中的殘基 1 7 6 有更 精 確的 匹配 。 當(dāng)將

27、 X D H 中 殘 基 2 3 3～ 4 1 3的 c原 子 位 置 與 C O D 中殘基 5 ～1 7 6 的進(jìn)行 比照時 ， 顯示 出 1 ． 4A 的均方根 偏 差。而另 一半 F A D域 ( X D H 中殘基 4 1 4～ 5 2 6和 C O D 中殘 基 1 7 7～ 2 8 5 ) 均方 根偏 差是 1 ． 7A 。雖然 相 比于 X D H ， C O D中黃素環(huán)位置傾斜到結(jié)合囊中， 但是 2個域之間的相似點(diǎn)也

28、延伸到圍繞異 咯嗪環(huán)嘧啶部分的氫鍵模式。F A D并合成一 個處 于深裂 中的擴(kuò)展構(gòu) 象 ， 其 異咯 嗪環(huán)在 s i 一 面上 高度 親溶 劑 。N A D分 子有足夠 的空間伸展 煙酰胺環(huán)方 向 ， 使之 與異 咯 嗪平 行 。畜禽類 如雞 的 X D H殘基 T y r4 1 9經(jīng)親 和標(biāo) 記后 ， 使 用對 氟磺酰苯 甲酰腺苷 鹽酸鹽進(jìn)行 N A D結(jié) 合干擾 。畜牧 類如牛的 X D H中相應(yīng)的殘基( T y r3 9 3 )

29、 位于靠近 F A D結(jié)合 裂縫的表面?？梢韵胂蟮牡?， 如此龐大的基 團(tuán)被加入到其環(huán) 中足 以阻礙 與 N A D 的結(jié) 合 。盡 管 有 F A D輔 因子 的便 捷 通 道 ， X D H卻 展現(xiàn) 出相 對較低 的氧活性 。酶 基質(zhì) 中黃 素 中性 半 醌的穩(wěn)定 化處理 ， 可 以用 來闡 明這個 現(xiàn)象 。在黃素輔因子一側(cè)的 P h e3 3 7側(cè)鏈 ， 與異咯嗪環(huán)嘧啶部 分發(fā)生 霄 一 竹反應(yīng) 。相 當(dāng)于牛奶 X D H 中 P

30、h e3 3 7的殘基 ， 被 保 留在 已知 的黃嘌呤 氧化還原酶 中 ， 畜牧類 如牛 的 A L O芳香族 氨 基酸為亮 氨 酸所 取 代 。還 應(yīng) 該指 出的是 ， A s p4 2 9帶 負(fù) 電 荷 的側(cè)鏈距離 黃素 的 C 6只有 3 ． 6A， 附近并沒 有直接 電荷補(bǔ) 償 。只有幾個 環(huán)繞 著 A s p4 2 9的水分 子 依次 與 F e y SI I 醛酮 類 主干結(jié)合成 環(huán) 。一般 的靜 電效應(yīng) 可 以通過 異

31、咯 嗪環(huán) 和 一 些醛 酮類主 干 間 7． 和 8 僅 ． 甲基原 子 團(tuán)短 時 間接 觸 而 增 加 。8一甲基碳原 子距離 T h r2 6 2的羰 基 3 ． 5A， 距離 G l u 4 5 的羰 基 3 ． 3A 。7一 甲基碳原子則 距離 G l y4 6的羰 基 3 ． 2A 。G l u4 5 和 G l u4 6 屬 于 F e ／ SI I 中心 的緊密循 環(huán)結(jié) 合 ， 同時將 F e ／ S簇 與黃素環(huán)分 隔開

32、。2 ． 4X D H 和 X O 形 式的 比較 X D H和 XO的 電子 密度 圖之 間最 明顯的 區(qū)別 在于 ， X O的圖 中沒有更 長的多肽鏈 ， 如在 X D H的氨基 酸 5 2 9— 5 7 0 組 成一 個 僅螺旋 、 一 個 1 3 折 疊 和一 個環(huán)， 共 同跨越約7 0A的距離。盡管可 以把在 X D H晶體結(jié) 構(gòu)丟失 的電子密度 歸屬于相 應(yīng) 的殘 基遷移 率 ( 酶在 十二烷 基 磺 酸鈉 S D S 凝膠

33、 中以單 波段運(yùn)行 ) ， 可想 而知 在 X O形 式 中 ，考 慮到蛋 白水解物 的性 質(zhì) ， 丟失 的氨基 酸實(shí) 際上是 從 蛋 白質(zhì) 分 子 中遷移 了 。X D H和 X O的全 折疊依 然非 常相 似 ， 在 2 個 F e ／ S中心或附 近 和 M o — p t 中心 無 觀顯 著變 化 。X D H 和 X O中結(jié)合 F e ／ S 域 和 M o — p t 域 之 間 c位 置 的 均 方 根 偏 差 為 8 8

34、 9 C原子 的 0 ． 3 4A 。一 般 的結(jié) 構(gòu) 保持 與 動力 學(xué) 研 究 相一 致 ， 說 明 2 種結(jié)合 酶的形 式之 間 和 M o — p t 中心用 于 催化 的底 物 間無 顯著性 差異 。從 X D H到 X O的可 逆轉(zhuǎn) 換 可 以通過 修飾 C y s5 3 5 和 C y s9 9 2 而獲得”。C y s9 9 2的 c原子和 殘基 5 3 7 相 距 1 5 ． 7A 。二硫 鍵 的形 成 是其 中一 種

35、可 能 的轉(zhuǎn) 換機(jī) 制 。關(guān) 于氧化性 X D H ／ X O轉(zhuǎn)換 的更加深 入的結(jié)構(gòu)解 釋 ，要等半胱氨酸修飾蛋白的晶體衍射特性明晰之后才能得到。X D H 的胰 蛋 白酶水解 作用 于 L y s5 5 1 后 或胰 酶 裂解 L e u2 1 9和 L y s5 6 9后， 導(dǎo)致 X O不可逆轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)換。X O分子晶體可通 過胰酶水解作用制備出來 ， 因此其可能是在 L e u2 1 9和 L y s5 6 9 后 被裂解 。但 是