惡性瘧原蟲(chóng)次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶細(xì)胞免疫保護(hù)作用的研究.pdf

1、瘧疾目前仍然是嚴(yán)重威脅人類健康的寄生蟲(chóng)病，由于瘧原蟲(chóng)抗藥性以及蚊媒抗殺蟲(chóng)劑的產(chǎn)生和擴(kuò)散，使瘧疾防治面臨嚴(yán)重困難。因此，研制有效的瘧疾疫苗己成為瘧疾防治重要潛在的替代途徑。 研制瘧疾紅內(nèi)期疫苗對(duì)降低瘧疾的發(fā)病率和死亡率具有重要作用。針對(duì)紅內(nèi)期原蟲(chóng)免疫保護(hù)機(jī)制的研究，早期工作主要集中在體液免疫的作用。事實(shí)上紅內(nèi)期原蟲(chóng)確能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這類抗體在體外能完全抑制瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)，許多動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果也表明抗體在清除紅內(nèi)期原蟲(chóng)感染中發(fā)揮重要作

2、用。由于紅細(xì)胞表面缺乏MHC分子，因此細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)紅內(nèi)期原蟲(chóng)不能發(fā)揮效應(yīng)作用。但實(shí)驗(yàn)表明，在B細(xì)胞缺陷的小鼠模型中進(jìn)行免疫攻擊感染試驗(yàn)，結(jié)果顯示免疫小鼠能產(chǎn)生對(duì)瘧原蟲(chóng)攻擊感染的免疫保護(hù)效力。盡管這種免疫力不能完全清除攻擊感染的瘧原蟲(chóng)，但可控制原蟲(chóng)密度在很低水平。顯然，該免疫保護(hù)效力是由細(xì)胞免疫介導(dǎo)的。此外，CD4+T細(xì)胞過(guò)繼免疫小鼠也能對(duì)瘧原蟲(chóng)攻擊感染產(chǎn)生保護(hù)作用。這些結(jié)果表明在瘧原蟲(chóng)的紅內(nèi)期免疫機(jī)制中，體液免疫和CD

3、4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫均發(fā)揮重要的作用。 近年來(lái)，許多紅內(nèi)期疫苗候選抗原陸續(xù)得到鑒定，但這些抗原中絕大多數(shù)是針對(duì)保護(hù)性體液免疫的抗原。最近Makobongo等將所有紅內(nèi)期原蟲(chóng)抗原進(jìn)行組分化并建立各組分的CD4+T細(xì)胞品系，通過(guò)過(guò)繼免疫和攻擊感染試驗(yàn)確定了具有保護(hù)保護(hù)作用的T細(xì)胞品系，并初步鑒定瘧原蟲(chóng)次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-黃嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthineguaninexanthinephosphoribosyltra

4、nsferase，HGXPRT)為這種保護(hù)性CD4+T細(xì)胞的靶抗原。HGXPRT是嘌呤核苷酸補(bǔ)救合成途徑中的一個(gè)酶，可催化5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)與嘌呤反應(yīng)生成嘌呤核苷酸。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，除有補(bǔ)救合成途徑外，還有嘌呤核苷酸從頭合成途徑，但在瘧原蟲(chóng)僅有補(bǔ)救合成途徑，只能利用補(bǔ)救途徑合成生命所必需的核苷酸，故而HGXPRT對(duì)于瘧原蟲(chóng)便顯得尤為重要，成為廣泛關(guān)注的抗瘧疾藥物的靶標(biāo)。因此有必要制備重組蛋白建立特異T細(xì)胞品系，以進(jìn)一步確定其

5、細(xì)胞免疫的免疫保護(hù)作用，并在此基礎(chǔ)上鑒定其保護(hù)性T細(xì)胞表位。 本實(shí)驗(yàn)室利用畢氏酵母系統(tǒng)表達(dá)并純化了惡性瘧原蟲(chóng)HGXPRT重組蛋白，SDS-PAGE顯示其分子量約為25KD，與理論分子量26.232KD接近。WesternBlot檢測(cè)該重組蛋白可與疫區(qū)患者血清反應(yīng)。本研究在此基礎(chǔ)上，將HGXPRT重組蛋白與完全弗氏佐劑(CFA)乳化并免疫BALB/c小鼠，在第四和第六周以不完全弗氏佐劑(IFA)乳化蛋白加強(qiáng)免疫兩次，并設(shè)立小牛血清

6、白蛋白(BSA)和PBS對(duì)照組，在末次免疫10天后用約氏瘧原蟲(chóng)進(jìn)行攻擊感染，自感染次日起，每日制備薄血膜鏡檢原蟲(chóng)率。結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠在攻擊感染后20天全部死亡，而免疫組50％小鼠能存活并痊愈，原蟲(chóng)密度峰值低于對(duì)照組。ELISA結(jié)果顯示，三次免疫血清抗體滴度次第升高，至末次免疫時(shí)可達(dá)105以上。 為研究HGXPRT抗原的細(xì)胞免疫作用，我們建立了HGXPRT特異性的T細(xì)胞品系。用重組HGXPRT蛋白免疫BALB/c小鼠雙側(cè)上肢、雙

7、足墊和腹膜內(nèi)，7～10天后取腋下、腹股溝、腘窩淋巴結(jié)和脾臟制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行體外培養(yǎng)。在培養(yǎng)物中加入濃度為5μg/ml的HGXPRT抗原刺激，培養(yǎng)7天(此階段培養(yǎng)稱刺激期)。此后，更換新鮮完全1640培養(yǎng)基，加入適量飼養(yǎng)細(xì)胞及10U/ml的小鼠IL-2，但不加抗原，繼續(xù)培養(yǎng)7天(此階段培養(yǎng)稱間歇期)；7天后再更換1640培養(yǎng)基，并加入抗原、飼養(yǎng)細(xì)胞和小鼠IL-2，培養(yǎng)7天。如此反復(fù)進(jìn)行刺激-間歇-刺激循環(huán)，根據(jù)細(xì)胞增殖情況，分瓶傳代。同

8、時(shí)以小牛血清白蛋白(BSA)作為對(duì)照，建立BSA特異性的T淋巴細(xì)胞系。采用[3H]-TdR摻入法檢測(cè)各TF細(xì)胞系的淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示在HGXPRT的刺激下，淋巴細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的增殖，cpm均值為100,82.67，明顯高于HGXPRT抗原致敏的小鼠脾臟及淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖(cpm為6,205)，表明經(jīng)過(guò)刺激-間歇-刺激循環(huán)，己成功建立HGXPRT特異T細(xì)胞品系。 為表明HGXPRT特異T細(xì)胞的免疫保護(hù)作用，我們開(kāi)展了過(guò)繼免

9、疫瘧原蟲(chóng)攻擊實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為三組，分別為HGXPRT特異性的T淋巴細(xì)胞組、BSA特異的T淋巴細(xì)胞組、PBS組，每組5只裸鼠。經(jīng)尾靜脈注射T細(xì)胞，劑量為107細(xì)胞/只、PBS組為100μlPBS/只。24h后，靜脈注射105約氏瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞進(jìn)行攻擊感染，次日起每日制備薄血膜鏡檢原蟲(chóng)率。三組原蟲(chóng)率比較顯示對(duì)照組原蟲(chóng)率上升急速，BSA組和PBS組原蟲(chóng)率峰值分別出現(xiàn)在感染后第14和第7天，原蟲(chóng)率分別為78.09％和82.44％，而HGXPR

10、T組原蟲(chóng)率較為平緩，峰值出現(xiàn)在感染后第28天，原蟲(chóng)率為68.74％。比較三組小鼠生存時(shí)間顯示，BSA組第2和第1、3、4號(hào)小鼠分別于死于感染后第8和第9天，第5號(hào)小鼠在感染后第15天死亡；PBS組小鼠在感染后第9天全部死亡，而HGXPRT組小鼠生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，自感染后第22天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，至第35天時(shí)全部死亡。結(jié)果表明，HGXPRT特異T細(xì)胞能控制瘧原蟲(chóng)密度在較低的水平，特別是在過(guò)繼免疫后開(kāi)始階段作用明顯，延長(zhǎng)免疫小鼠的生存時(shí)間。

11、 綜上所述，本研究采用畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的惡性瘧原蟲(chóng)HGXPRT重組蛋白，建立了抗原特異的T細(xì)胞品系，通過(guò)過(guò)繼免疫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明了HGXPRT特異T細(xì)胞對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)的攻擊感染具有明顯的免疫保護(hù)作用。此外，用重組HGXPRT免疫也能產(chǎn)生部分免疫保護(hù)作用。這些結(jié)果提示HGXPRT能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性T細(xì)胞免疫，這為今后鑒定瘧原蟲(chóng)HGXPRT抗原保護(hù)性T細(xì)胞表位提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這種保護(hù)性T細(xì)胞一旦鑒定，我們將其摻入到本室構(gòu)建的PfCP-2.