弓形蟲次黃嘌呤-黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HXGPRT）和腺苷激酶（AK）基因的克隆、表達及多抗血清的制備.pdf

1、目的：克隆弓形蟲RH株次黃嘌呤-黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HXGPRT)和腺苷激酶(AK)基因，構建原核表達載體pET28a/HXGPRT和pET28a/AK，表達HXGPRT和AK重組蛋白，利用此重組蛋白免疫新西蘭白兔制備多抗血清。 方法：復蘇本室液氮保種的弓形蟲RH株速殖子，腹腔接種BALB/c小鼠，轉種3代，抽取腹水，收集、純化弓形蟲株速殖子，提取總RNA，在設計合成的引物中引入BamHI和XhoI酶切位點。應用RT-

2、PCR擴增弓形蟲HXGPRT，AK基因片段，目的基因HXGPRT插入克隆載體pMD18-T，目的基因AK插入克隆載體pGEM-T，提取重組質粒，BamHI和XhoI雙酶切獲得目的基因，插入原核表達質粒pET28a中，重組子雙酶切、PCR和測序鑒定，轉化大腸桿菌E．coli BL21(DE3)并以IPTG誘導表達。親和層析法純化重組蛋白抗原，SDS-PAGE和Western blotting驗證表達量和免疫活性，改良的Bradford(考

3、馬斯亮藍)法測定純化rHXGPRT和rAK蛋白濃度。免疫新西蘭白，收集多抗血清，ELISA測定多抗滴度，Western blotting鑒定免疫活性。 結果：RT-PCR從弓形蟲RH株RNA中擴增出693bp的HXGPRT和1092bp的AK目標基因片段。成功地將其克隆入pET28a。pET28a/HXGPRT和pET28a/AK經BamHI和XhoI雙酶切，獲得與目標基因大小相一致的基因片段，測序結果與GenBank比對HXG

4、PRT同源性100％，AK同源性99.9％。含pET28a/HXGPRT和pET28a/AK的宿主菌E．coliBL21(DE3)經IPTG誘導后高效表達上述2個重組蛋白，經Ni<'2+>親和層析法純化獲得了高純度的rHXGPRT和rAK蛋白。SDS-PAGE檢測其分子量：rHXGPRT為26.4kDa，rAK為38.357kDa，二者與各自預期分子量大小相符。Western blotting顯示：rHXGPRT能夠被弓形蟲患者血清中的

5、IgG抗體和Torch-ELISA試劑合中的Tox-IgG陽性控制血清識別，rAK能夠被Torch試劑合中的Tox-IgG陽性控制血清識別，獲得了兩種純化的具有特異免疫反應性的重組蛋白。rHXGPRT和rAK分別免疫新西蘭白兔，獲得ELISA滴度為1∶10<'7>和1∶10<'6>兩種多價抗血清，Westernblotting顯示，每種多價血清不僅能和其對應的重組蛋白而且和蟲體內相應蛋白發(fā)生特異性免疫反應。 結論：成功地從弓形蟲