體外篩選具黃嘌呤氧化酶抑制活性的天然產(chǎn)物.pdf

1、近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，痛風(fēng)的發(fā)病率也呈逐漸上升趨勢(shì)。痛風(fēng)是由于體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，產(chǎn)生尿酸過(guò)多或尿酸排泄過(guò)少而導(dǎo)致血中尿酸升高，尿酸鹽結(jié)晶沉積在組織中引起的反復(fù)發(fā)作性炎癥疾病。臨床上治療痛風(fēng)的方法主要包括促進(jìn)尿酸排泄和抑制尿酸生成。其中，通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性減少尿酸的生成被認(rèn)為是治療痛風(fēng)的最有效的方法之一。體內(nèi)次黃嘌呤可在黃嘌呤氧化酶的催化下生成黃嘌呤，進(jìn)一步生成尿酸，故抑制黃嘌呤氧化酶的活性可顯著降低尿酸的生成。目前臨

2、床應(yīng)用的抗痛風(fēng)藥物的不良反應(yīng)越來(lái)越突出，人們開(kāi)始傾向于從天然產(chǎn)物中篩選具有抗痛風(fēng)活性的化學(xué)成分。我國(guó)中藥資源豐富、中藥的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多樣，作用靶點(diǎn)眾多，因此從中藥中篩選高效、低毒的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有良好的應(yīng)用前景。
　　黃嘌呤氧化酶抑制劑的體外篩選方法包括紫外分光光度法、電化學(xué)法、超高效液相色譜法等，但都存在不同的缺點(diǎn)，因此，本課題擬基于高效液相色譜（HPLC）建立一種簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的體外篩選方法，并利用建立的方法篩選中藥及

3、天然產(chǎn)物中具有黃嘌呤氧化酶抑制活性的先導(dǎo)化合物，為抗痛風(fēng)新藥的研究提供理論依據(jù)。
　　目的：建立基于HPLC體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的新方法；利用該方法考察具有抗痛風(fēng)活性中藥的黃嘌呤氧化酶抑制活性；選擇活性最好的中藥作為研究對(duì)象進(jìn)行活性追蹤分離，以期獲得活性較好的先導(dǎo)化合物。
　　方法：通過(guò)HPLC測(cè)定酶促反應(yīng)體系中底物黃嘌呤在反應(yīng)前后含量的變化，建立體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法。色譜條件如下：Agilent SB-C

4、18柱，4.6 mm?250 mm，5?m；流動(dòng)相，0.02 mol·L-1 KH2PO4（含甲醇1％）；流速，1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量，20?柱溫，室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)，254 nm。利用建立的方法對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道具有抗痛風(fēng)活性的14味中藥，即蘇木、海桐皮、牡丹皮、秦皮、虎杖、威靈仙、玉米須、土茯苓、金錢(qián)草，使君子、葛花、秦艽、高良姜和樗白皮進(jìn)行了黃嘌呤氧化酶抑制活性的考察，并對(duì)其中抑制活性最好的中藥牡丹皮在活性追蹤指導(dǎo)下進(jìn)行了化學(xué)成分研

5、究，結(jié)合質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)，對(duì)得到的單體化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其黃嘌呤氧化酶抑制活性進(jìn)行了考察。
　　結(jié)果：基于HPLC體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法線(xiàn)性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率結(jié)果均符合方法學(xué)考察的要求。利用該方法對(duì)14味中藥進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)使君子、蘇木、虎杖和牡丹皮四味中藥70%乙醇提取物的酶抑制作用較強(qiáng)，其IC50分別為10.04、8.02、2.06和1.36 mg·mL-1。對(duì)活性最好的中藥牡丹皮進(jìn)行活性

6、成分追蹤，從其乙酸乙酯和正丁醇部位分得15個(gè)化合物，分別鑒定為沒(méi)食子酸（1），沒(méi)食子酸甲酯（2），沒(méi)食子酸乙酯（3），槲皮素（4），兒茶素（5），胡蘿卜苷（6），芍藥苷（7），牡丹苷 D（8），4-O-甲基氧化芍藥苷（9），沒(méi)食子酰氧化芍藥苷（10），丹皮酚（11），丹皮酚原苷（12），沒(méi)食子酰氧化芍藥苷 B（13），丹皮酚新苷（14）和沒(méi)食子氧化芍藥苷D（15）。進(jìn)一步活性篩選發(fā)現(xiàn)，化合物1-5，10，13和15具有黃嘌呤氧化酶抑制活

7、性，其中化合物1-3，10，13和15活性較強(qiáng)，其IC50分別為2.04，1.91，3.60，0.75，1.28，0.97 mmol·L-1。此外，針對(duì)活性較好的蘇木，對(duì)前期本課題組分離得到的24個(gè)單體化合物進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)化合物7,3',4'-三羥基-3-芐基-2氫-苯并吡喃，3-去氧蘇木酮B，蘇木查爾酮和原蘇木素A具有一定的活性。
　　結(jié)論：基于 HPLC法體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法操作簡(jiǎn)單、快速、可靠且易推廣，為黃嘌