肺炎鏈球菌誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)人β防御素2及白藜蘆醇的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　1.觀察肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，SP)誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來(lái)源肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞人β防御素2（humanβ denfensin2，hBD2）的表達(dá);
　　2.探討TLR2、MAPKs信號(hào)分子在SP感染的A549細(xì)胞表達(dá)hBD2中的作用;
　　3.闡明白藜蘆醇(Resveratrol，Res)對(duì)SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞hBD2 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用;
　　

2、4.研究沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（Sirtuin1，SIRT1）在Res調(diào)節(jié)SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞表達(dá)hBD2 mRNA中的作用。
　　方法：
　　奧普托欣實(shí)驗(yàn)觀察菌株抑菌環(huán)直徑。A549細(xì)胞培養(yǎng)傳代后接種于6孔板或96孔板，RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞（含10％FBS），待細(xì)胞生長(zhǎng)至70％～80％融合時(shí)， SP感染細(xì)胞以建立細(xì)胞感染模型，細(xì)菌感染前24h改用無(wú)雙抗RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法如下:
　　1.S

3、P感染對(duì)細(xì)胞活力的影響
　　SP以不同感染復(fù)數(shù)（MOI分別為0、1、20、50）感染A549細(xì)胞，于感染后12h終止感染，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力;SP感染A549細(xì)胞(MOI:20)，分別于感染后0h、6h、12h、18h、24h終止感染，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　2.SP對(duì)A549細(xì)胞hBD2的誘導(dǎo)表達(dá)是否存在時(shí)間及MOI依賴性
　　SP感染A549細(xì)胞(MOI:20)，分別于感染后0h、2h、4h、6h、8

4、h、12h、18h、24h終止感染;SP以不同MOI(0、1、20、50)感染A549細(xì)胞，于感染后6h或12h終止感染。應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)hBD2 mRNA水平(感染后6h)，ELISA法檢測(cè)hBD2蛋白表達(dá)（感染后12h）。
　　3.A549細(xì)胞TLR2表達(dá)
　　SP感染A549細(xì)胞(MOI:20)，實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組（以0.01M PBS代替一抗）、對(duì)照組（未感染組）、SP組（SP感染組），于感染后6h終止感染。應(yīng)

5、用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TLR2表達(dá)。
　　4.TLR2功能性抗體對(duì)SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞表達(dá)hBD2的影響
　　SP感染A549細(xì)胞(MOI:20)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（未感染組）、SP組（SP感染組）、TLR2抗體組(10 ug/ml TLR2功能性抗體預(yù)處理1h)、TLR2抗體+SP組（10 ug/ml TLR2功能性抗體預(yù)處理1h+SP感染），于感染后6h或12h終止感染。應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞hBD2 mRNA水平（感

6、染后6h），ELISA法檢測(cè)hBD2蛋白水平(感染后12h)。
　　5.不同MAPKs信號(hào)分子抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　10μM U0126（MEK1/2特異性抑制劑，抑制ERK磷酸化）、25μMSP600125（JNK特異性抑制劑，抑制JNK磷酸化）、10μMSB202190(p38特異性抑制劑，抑制p38磷酸化)預(yù)處理A549細(xì)胞1h，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組（含細(xì)胞，無(wú)抑制劑的培養(yǎng)基），CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　

7、　6.與SP誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)hBD2有關(guān)的MAPKs信號(hào)分子
　　SP感染A549細(xì)胞(MOI:20)，分別于感染后0h、0.5h、2h、4h終止感染，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞磷酸化MAPKs水平，以0h組為對(duì)照組;抑制實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組、SP感染組、U0126組（10μM）、U0126+SP組、SP600125組(25μM)、SP600125+SP組、SB202190(10μM)、SB202190+SP組，各抑制劑分別預(yù)

8、處理細(xì)胞1h，SP感染細(xì)胞6h(MOI:20)，qRT-PCR檢測(cè)hBD2mRNA水平。
　　7.不同濃度Res、尼克酰胺(Niacinamide，Nam)對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響
　　不同濃度Res(10μM、25μM、50μM、75μM、100μM)及不同濃度Nam(2.5 mM、5 mM、10 mM、20 mM、40 mM)預(yù)處理A549細(xì)胞24h，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組（含細(xì)胞，無(wú)藥物的培養(yǎng)基），CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

9、。
　　8.Res對(duì)SP感染后細(xì)胞活力的影響
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（無(wú)藥物、無(wú)SP感染）、SP組（SP感染）、SR1組(10μMRes+SP感染)、SR2組（25μM Res+SP感染）、SR3組（50μM Res+SP感染），各濃度Res預(yù)處理細(xì)胞24h，SP感染細(xì)胞18h(MOI:20)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　9.A549細(xì)胞SIRT1蛋白定位表達(dá)
　　SP感染A549細(xì)胞(MOI:20)，實(shí)驗(yàn)分為

10、同型對(duì)照組（以同型對(duì)照抗體代替一抗）、對(duì)照組（未感染組）、SP組（SP感染組），于感染后6h終止感染。免疫熒光法檢測(cè)A549細(xì)胞SIRT1蛋白在細(xì)胞的定位表達(dá)。
　　10.不同濃度Res對(duì)SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞hBD2 mRNA表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、SP感染組、Res+SP感染組，后者根據(jù)Res濃度(10μM、25μM、50μM)不同分3組，Res預(yù)處理細(xì)胞24h，SP感染細(xì)胞6h(MOI:20)，qRT-PCR檢測(cè)

11、hBD2 mRNA水平。
　　11.SP感染A549細(xì)胞后，SIRT1蛋白時(shí)間動(dòng)態(tài)變化
　　SP感染細(xì)胞(MOI:20)，分別于感染后0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h終止感染，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞SIRT1蛋白水平，以0h組為對(duì)照組。
　　12.不同濃度Res對(duì)SP感染后A549細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)影響
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、SP感染組、Res+SP感染組，后者根據(jù)Res濃度（10μM

12、、25μM、50μM）不同分3組，Res預(yù)處理細(xì)胞24h，SP感染細(xì)胞6h(MOI:20)，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)。
　　13.SIRT1在Res調(diào)節(jié)SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞表達(dá)hBD2 mRNA中的作用
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（未感染組）、SP組（SP感染組）、SR組(50μM Res+SP感染)、SRN組（50μM Res+10mM Nam+SP感染），Res或Res+Nam預(yù)處理細(xì)胞24h，SP感染

13、細(xì)胞6h(MOI:20)，qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞hBD2 mRNA水平。
　　結(jié)果：
　　1.奧普托欣實(shí)驗(yàn)
　　35℃培養(yǎng)箱孵育18-24h后，菌株抑菌環(huán)直徑＞14mm，提示為SP。
　　2.A549細(xì)胞形態(tài)觀察
　　未感染A549細(xì)胞呈圓形、橢圓形、多角形和梭形等多種形態(tài)。SP感染A549細(xì)胞后，細(xì)胞呈圓形、橢圓形或梭形，細(xì)胞體積縮小，兩側(cè)有突起，胞漿增多，胞漿內(nèi)可見(jiàn)空泡、多個(gè)顆粒，核漿比例減小。

14、　　3.SP以MOI和時(shí)間依賴性方式影響A549細(xì)胞活力
　　隨MOI增加，細(xì)胞活力降低。感染時(shí)間為12h時(shí)，與對(duì)照組比較，MOI50組A549細(xì)胞活力顯著降低(P＜0.01)。隨SP感染時(shí)間延長(zhǎng)，A549細(xì)胞活力降低。MOI為20時(shí)，SP感染18h、24h后，細(xì)胞活力較對(duì)照組顯著降低（分別為P＜0.05、P＜0.01）。
　　4.SP誘導(dǎo)A549細(xì)胞hBD2表達(dá)
　　4.1 SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞hBD2時(shí)間動(dòng)態(tài)變化

15、 qRT-PCR檢測(cè)顯示，A549細(xì)胞中hBD2 mRNA感染后4h開(kāi)始上升(P＜0.01)，8h達(dá)高峰，12h開(kāi)始下降; ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液hBD2蛋白水平，結(jié)果顯示hBD2蛋白于感染后4h升高(P＞0.05)，6h顯著上升(P＜0.01)，持續(xù)至24 h。
　　4.2不同MOI感染后，SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞hBD2表達(dá) qRT-PCR和ELISA檢測(cè)顯示，hBD2 mRNA及蛋白隨MOI增加表達(dá)增多;MOI為50時(shí)，h

16、BD2mRNA及蛋白表達(dá)最高;MOI為1時(shí)，與對(duì)照組比較，hBD2 mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　5.A549細(xì)胞TLR2表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示，正常A549細(xì)胞有TLR2輕度表達(dá)，呈棕黃色顆粒，主要分布在胞膜;SP感染后的A549細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒明顯增加，SP組TLR2 MOD值明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　6.TLR2介導(dǎo)SP感染的A549細(xì)胞hBD2的釋放
　　SP

17、組hBD2 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，TLR2功能性抗體顯著抑制SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞釋放hBD2(P＜0.01)。
　　7.不同MAPKs抑制劑對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響
　　與對(duì)照組比較，U0126(10μM)、SB202190(10μM)、SP600125(25μM)預(yù)處理1h對(duì)A549細(xì)胞增殖均無(wú)影響(P＞0.05)。
　　8.MAPKs在SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞hBD2 mRNA表達(dá)中的作

18、用
　　8.1 SP感染后A549細(xì)胞磷酸化MAPKs時(shí)間動(dòng)態(tài)變化 p-ERK1/2、p-p38均于SP感染后0.5h開(kāi)始升高(P＜0.01或P＜0.05)，2h達(dá)高峰，4h回復(fù)到基線水平;SP感染A549細(xì)胞后未見(jiàn)JNK磷酸化活化。
　　8.2不同MAPKs抑制劑對(duì)SP感染后A549細(xì)胞hBD2 mRNA的影響 SP組、U0126+SP組、SP600125+SP組hBD2 mRNA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);SB

19、202190預(yù)處理抑制SP誘導(dǎo)的hBD2 mRNA表達(dá)（P＜0.01）。
　　9.不同濃度Res或Nam對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響
　　CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，10μM、25μM、50μM Res及2.5 mM、5 mM、10 mM、20 mM Nam預(yù)處理24h對(duì)A549細(xì)胞增殖均無(wú)影響（P均＞0.05）;75μM、100μM Res及40 mMNam預(yù)處理24h顯著影響A549細(xì)胞活力。
　　10.R

20、es對(duì)SP感染后細(xì)胞活力的影響
　　與對(duì)照組比較，SP感染(MOI:20)18h，顯著降低細(xì)胞活力(P＜0.01);與SP組比較，25μM、50μM Res預(yù)處理24h均可顯著改善SP感染后的細(xì)胞活力（P均＜0.01）。
　　11.免疫熒光法檢測(cè)A549細(xì)胞SIRT1蛋白定位表達(dá)
　　免疫熒光顯示A549細(xì)胞SIRT1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞核內(nèi)，SP感染后 SIRT1蛋白表達(dá)增加。
　　12.不同濃度Res對(duì)SP誘

21、導(dǎo)的A549細(xì)胞hBD2 mRNA表達(dá)的影響
　　SP感染誘導(dǎo)A549細(xì)胞hBD2 mRNA表達(dá)(P＜0.01);25μM、50μM Res預(yù)處理顯著增加SP誘導(dǎo)的hBD2 mRNA表達(dá)（P＜0.01）。
　　13.SIRT1蛋白隨SP感染時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化
　　SIRT1蛋白于SP感染后1h開(kāi)始升高，2h顯著升高（P＜0.05），4h達(dá)高峰(P＜0.01)，6h開(kāi)始下降，24h回到基線水平。
　　14.Res對(duì)SP

22、感染的A549細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的影響
　　SP感染(MOI:20)后6h，A549細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.01);Res以濃度依賴性方式增加SP感染的A549細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)。
　　15.SIRT1在Res調(diào)節(jié)SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞表達(dá)hBD2 mRNA中的作用
　　SP組、SR組、SRN組hBD2 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）;Res顯著增加SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞hBD2

23、mRNA表達(dá)（P＜0.01）;SIRT1抑制劑Nam降低Res對(duì)SP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞hBD2 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用。
　　16.SIRT1蛋白與hBD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析
　　Res預(yù)處理SP感染(MOI:20)的A549細(xì)胞，細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)(MOD值)與hBD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r=0.931，P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.SP以時(shí)間和感染復(fù)數(shù)依賴性方式誘導(dǎo)A54