豬β-防御素基因表達特點及精氨酸的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、防御素(β-defensin)是抗微生物免疫的直接效應(yīng)分子,在防御多種細菌、真菌、原蟲和病毒對機體的入侵中發(fā)揮了重要的作用;此外,它還在先天性免疫和獲得性免疫之間起到橋梁作用。精氨酸(arginine,Arg)是一種免疫增強劑,對動物免疫器官發(fā)育、細胞免疫和體液免疫都有影響,且在緩解動物應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。但是,目前關(guān)于豬防御素(porcineβ-defensin,pBD)基因表達規(guī)律及Arg對pBD表達的調(diào)節(jié)作用尚未見報道。因此,本研

2、究旨在通過2個體內(nèi)試驗和2個體外試驗考察pBD基因表達在不同品種和不同組織之間的差異以及Arg處理對其表達的影響,從而揭示pBD基因的表達特點和Arg對其表達的調(diào)節(jié)作用。試驗一 DIY和藏豬pBD-1、2和3基因表達差異的研究
　　 為了比較pBD-1、2和3基因在DLY豬(杜×長×大雜交豬)和藏豬組織中的表達差異,本試驗選取健康的7日齡藏豬和DLY豬各6頭,屠宰后立即取其心、肝、脾、肺、腎、腦、皮膚、肌肉、口腔黏膜、呼吸道上皮

3、、舌、胸腺、小腸黏膜、生殖道上皮、睪丸(公)或卵巢(母)等組織器官,提取總RNA,用Real-time PCR方法檢測pBD-1、2和3基因mRNA表達水平。結(jié)果表明：試驗所取組織中均能檢測到pBD基因mRNA的表達。pBD-1和3表達量最高的組織是舌和口腔黏膜,且藏豬大部分組織中pBD-1和3基因mRNA表達量要高于DLY豬;而pBD-2表達量最高的組織是腎臟和肝臟,且DLY豬大部分組織的pBD-2基因mRNA表達量高于藏豬。結(jié)果表明

4、,pBD的表達存在明顯的品種差異和組織特異性。
　　 試驗二 Arg、Ile和Zn2+對IPEC-J2細胞系pBD-1、2和3基因mRNA與蛋白表達的影響
　　 為了研究Arg、異亮氨酸(Isoleucine,Ile)和Zn2+對pBD-1、2和3基因mRNA與蛋白質(zhì)表達水平的影響,本試驗以豬腸上皮細胞系IPEC-J2為體外研究模型,在無血清DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)分別單獨添加不同濃度的Arg、Ile和Zn2+培養(yǎng)細胞,

5、處理24 h后,分別提取總RNA和蛋白質(zhì)。用Real-time PCR法測定pBD-1、2和3基因mRNA表達水平,用ELISA方法測定pBD-1、2和3蛋白質(zhì)含量。結(jié)果顯示,Arg、Ile和Zn2+均能夠不同程度的誘導(dǎo)豬腸上皮細胞系pBD基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。其中,不同處理濃度的Arg均能提高pBD的基因和蛋白的表達,且以100μg/mL Arg是刺激pBD-1、2和3基因mRNA和蛋白質(zhì)表達的最適濃度。Ile和Zn2+

6、誘導(dǎo)pBD表達的最佳濃度分別是25μg/mL和100μmol/mL但其誘導(dǎo)作用均弱于Arg。結(jié)果表明,在本試驗濃度范圍內(nèi),Arg、Ile和Zn2+可以促進pBD-1、2和3基因mRNA與蛋白的表達,且以Arg對pBD-1、2和3表達的促進作用最優(yōu)。
　　 試驗三 Arg對DLY仔豬pBD-1、2和3基因表達的影響為了探討Arg在體內(nèi)對斷奶仔豬pBD基因表達的調(diào)節(jié)作用,本試驗選取產(chǎn)期、胎次和飼養(yǎng)環(huán)境相近的21日齡斷奶DLY仔豬36

7、頭。采用2×3因子試驗設(shè)計,按體重相近的原則隨機分為6組。試驗全期,1、4組飼喂基礎(chǔ)日糧,2、5組飼喂基礎(chǔ)+0.5％Arg日糧,3、6組飼喂基礎(chǔ)+1％.Arg日糧。試驗第8 d早上,空腹稱重后,處理4、5、6組,共18頭仔豬,通過接種4 mL S.C500(豬霍亂沙門氏菌C500)建立免疫應(yīng)激模型,1、2和3組注射生理鹽水。免疫應(yīng)激后第10 d屠宰取樣。結(jié)果表明：
　　 1.日糧添加Arg有增加仔豬平均日增重和日采食量趨勢,且顯

8、著地降低耗料增重比。接種S.C500誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激降低了仔豬生產(chǎn)性能,極顯著降低了仔豬接種S.C500后7d和全期日增重,極顯著降低接種S.C500后一周的采食量,免疫應(yīng)激后耗料增重比有降低的趨勢;S.C500誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激仔豬補充Arg有改善生產(chǎn)性能的作用。
　　 2.日糧中添加Arg可降低仔豬應(yīng)激前及應(yīng)激后1、3、7和10 d血清中尿素氮水平;S.C500誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激提高了應(yīng)激后1、3、7 d血清尿素氮水平。添加Arg和接

9、種S.C500在應(yīng)激后1和7 d對尿素氮的產(chǎn)生的影響具有互作效應(yīng),且日糧中1％Arg的添加對免疫應(yīng)激仔豬血清尿素氮的降低幅度優(yōu)于日糧中0.5％Arg的添加。
　　 3.對于未接種S.C500的仔豬,日糧中添加Arg提高血清游離Arg(應(yīng)激前及應(yīng)激后1、3、7和10 d)、鳥氨酸(應(yīng)激前及應(yīng)激后1、3、7和10 d)、和瓜氨酸(應(yīng)激前及應(yīng)激后3和7 d)濃度,降低蘇氨酸(應(yīng)激后1 d)、蛋氨酸(應(yīng)激后1、3、7和10 d)、纈氨酸

10、(應(yīng)激后1 d)及組氨酸濃度(應(yīng)激后7 d);接種S.C500誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激導(dǎo)致血清賴氨酸(應(yīng)激后1、3、7和10 d)、蛋氨酸(應(yīng)激后1、3和7 d)、纈氨酸(應(yīng)激后1、7和10 d)和苯丙氨酸(應(yīng)激后1、3、7和10 d)濃度增加,Arg(應(yīng)激后3 d)、瓜氨酸(應(yīng)激后1和3 d)和蘇氨酸(應(yīng)激后1、3和10 d)濃度降低。添加Arg和接種S.C500對蛋氨酸(應(yīng)激后3和7 d)、亮氨酸(應(yīng)激后7 d)、苯丙氨酸(應(yīng)激后7 d)和瓜

11、氨酸(應(yīng)激后7 d)濃度的影響具有互作效應(yīng)。
　　 4.日糧添加Arg增加了血清NO含量(應(yīng)激前)、TNOS(應(yīng)激后7 d)和iNOS(應(yīng)激后1、3和7 d)活性,cNOS活性沒有變化;接種S.C500增加血清NO(應(yīng)激后10 d)含量、TNOS(應(yīng)激后7 d)和iNOS(應(yīng)激后3和7 d)活性。添加Arg和接種S.C500對血清NO含量、TNOS和iNOS活性的影響無互作效應(yīng)。
　　 5.日糧中添加Arg增加了血清tg

12、A(應(yīng)激后3、7和10 d)、IgG(應(yīng)激后1、3、7和10 d)和IgM(應(yīng)激后3 d)的含量。接種S.C500增加血清IgA(應(yīng)激后3 d和10 d)、IgG(應(yīng)激后1 d、3 d和lO d)和IgM(應(yīng)激后1 d、7 d和10 d)含量。添加Arg和接種S.C500對血清IgA、IgG和IgM的影響無互作效應(yīng)。
　　 6.日糧添加Arg降低了血清IL-1β(應(yīng)激前及應(yīng)激后1 d、3 d和7 d)、TNF-α(應(yīng)激前及應(yīng)激后

13、1、7和10 d)和皮質(zhì)醇濃度(應(yīng)激前及應(yīng)激后1、3和10 d),而提高了IL-2(應(yīng)激后1、3和7d)濃度;接種S.C500提高了血清IL-1β(應(yīng)激后1、7和10d)、TNF-α(應(yīng)激后1、3、7和10 d)和皮質(zhì)醇(應(yīng)激后1、3和10 d)濃度,卻降低了IL-2(應(yīng)激后1、3、7和10 d)濃度。添加Arg和接種S.C500對血清IL-1β、TNF-α、皮質(zhì)醇和IL-2濃度的影響無互作效應(yīng)。
　　 7.日糧添加Arg增加了

14、肝腎iNOS、肝精氨酸酶Ⅰ和腎和空腸精氨酸酶Ⅱ的表達,降低空腸CAT-1、2和3的表達;接種S.C500降低肝eNOS、腎和空腸精氨酸酶Ⅱ的表達,提高空腸CAT-1、2的表達。添加Arg和接種S.C500對仔豬CAT-3的表達調(diào)節(jié)具有互作效應(yīng)。
　　 8.日糧添加Arg增加了舌、口腔黏膜、呼吸道黏膜、空腸黏膜、回腸黏膜、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)的pBD-1、2和3表達量;接種S.C500對pBD-1和3基因表達無顯著影響,但能

15、顯著提高pBD-2在舌、口腔黏膜、呼吸道黏膜、空腸黏膜、回腸黏膜、腸系膜淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)中的表達。添加Arg和接種S.C500的互作對腸系膜淋巴結(jié)pBD-1的影響具有互作效應(yīng),且對舌、口腔黏膜、空腸黏膜和腹股溝淋巴結(jié)中pBD-2表達的調(diào)節(jié)具有互作效應(yīng),并對肝、肌肉和空腸黏膜中pBD-3基因表達的調(diào)節(jié)具有互作效應(yīng)。
　　 以上結(jié)果表明,日糧添加Arg增加了各組織的pBD-1、2和3表達量;接種S.C500誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激提高pB

16、D-2基因的表達量,免疫應(yīng)激時日糧添加Arg增加了血清中IgA、IgG、IgM和IL-2,降低了血清中IL-1β、TNF-α和皮質(zhì)醇濃度,進而能減輕仔豬免疫應(yīng)激的影響。
　　 試驗四 Arg影響pBD-1、2和3基因表達信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的初步探索
　　 為初步揭示Arg誘導(dǎo)pBD-1、2和3基因表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,本試驗以IPEC-J2細胞系為研究模型,研究信號通路阻斷劑對Arg誘導(dǎo)pBD-1、2和3基因mRNA表達的影響。

17、試驗選用的信號通路阻斷劑有MG-132(NF-кB2通路阻斷劑)和PD98059(MEK-ERK通路阻斷劑),共設(shè)對照組、Arg組、MG-132組、PD98059組、Arg+MG-132組和Arg+PD98059組6個處理組。結(jié)果表明,MG-132極顯著降低了Arg對pBD-2基因mRNA表達的上調(diào)作用,而PD98059極顯著的降低了Arg對pBD-1和3基因mRNA表達的上調(diào)作用。結(jié)果表明,NF-кB通路可能是Arg調(diào)控pBD-2基因