歐前胡素和異歐前胡素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、歐前胡素和異歐前胡素屬于6，7-呋喃香豆素類化合物，因取代基位置不同互為位置異構(gòu)體。二者廣泛存在于植物界，尤其在傘形科中藥中含量豐富，均具有鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤、抗菌和抗HIV等藥理作用。此外，歐前胡素和異歐前胡素對(duì)藥物代謝酶-細(xì)胞色素酶P450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性有一定的影響。中藥成分復(fù)雜，各成分的體內(nèi)過程可能存在相互影響，對(duì)可影響藥物代謝酶活性的成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究顯得尤為重要。目前對(duì)于歐前胡素和異歐前胡素的藥代動(dòng)力學(xué)研究，多

2、是將其作為藥材整體藥動(dòng)學(xué)研究中的化合物進(jìn)行，尚未有二者單體藥代動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)研究。本研究以專屬、靈敏的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)為分析手段，分別建立了各種生物樣品中歐前胡素和異歐前胡素及其代謝物的定量測(cè)定方法，并用于二者分別灌胃大鼠后的藥代動(dòng)力學(xué)研究和比較，為中藥整體藥動(dòng)學(xué)的闡明奠定了基礎(chǔ)，為中藥位置異構(gòu)體藥動(dòng)學(xué)規(guī)律的尋找提供了借鑒。
　　第一部分歐前胡素的藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:1優(yōu)化中空纖維液液微萃取(

3、HF-LPME)條件，用于大鼠血漿、中歐前胡素及其代謝物花椒毒酚測(cè)定的樣品前處理;2建立血漿中歐前胡素及其代謝物花椒毒酚測(cè)定的HPLC-MS方法，研究大鼠灌胃歐前胡素后的藥代動(dòng)力學(xué)特征;3建立尿液和膽汁中歐前胡素及其代謝物花椒毒酚和花椒毒素測(cè)定的HPLC-MS方法，研究大鼠灌胃歐前胡素后的排泄動(dòng)力學(xué)特征。
　　方法:1以空白大鼠血漿和待測(cè)化合物對(duì)照品制備模擬生物樣本，按照單因素考察的方法依次考察并確定提取溶劑、中空纖維長(zhǎng)度、攪拌速

4、率、提取溫度、稀釋倍數(shù)和鹽效應(yīng)等提取條件，確定提取歐前胡素及其代謝物的最佳條件。Electrospray Ionization(ESI)源，源噴射電壓:5500 V;正離子模式監(jiān)測(cè);離子源溫度(TEM):650℃;歐前胡素、與花椒毒酚檢測(cè)離子對(duì)和DP電壓、CE電壓分別為271.1/203.2，25 V，15 eV和203.2/147.1，20 V，32 eV。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相體系為甲醇-1 mm

5、ol/L NH4Ac，梯度洗脫，流速0.8 mL/min;2結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對(duì)歐前胡素體內(nèi)定性研究的結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定測(cè)定化合物。灌胃給予大鼠歐前胡素后采集不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠血漿，采用已確定的HF-LPME處理血漿樣本。采用HPLC-MS方法測(cè)定。采用Electrospray Ionization(ESI)源，正離子模式監(jiān)測(cè)。源噴射電壓(IS):5500 V;離子源溫度:500℃;霧化氣(Gas1):40 psi，加熱氣(Gas2):50 p

6、si，簾氣:25 psi;以東莨菪內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)，采用Agilent Zorbax SB-C18柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相體系為甲醇-1 mmol/L NHAc，梯度洗脫，流速0.8 mL/min。36只大鼠灌胃給予歐前胡素后置于代謝籠內(nèi)，收集72小時(shí)內(nèi)0-4，4-8，8-12，12-24，24-36，36-48，48-60和60-72 h的尿液并記錄體積，采用與血漿樣品相同的HF-LPME預(yù)處理方法，另外6只大鼠麻醉后進(jìn)行膽管插管手術(shù)，收集24小

7、時(shí)內(nèi)0-2，2-4，4-8，8-12，12-20和20-24 h時(shí)間段的膽汁并記錄體積，用乙酸乙酯萃取的方式進(jìn)行預(yù)處理。尿液和膽汁樣品均在電噴霧離子(ESI)源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下進(jìn)行檢測(cè)。歐前胡素、花椒毒酚、花椒毒素和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子對(duì)和DP電壓、CE電壓分別為271.1/203.2,25 V,15 eV、203.2/147.1,20V,32 eV、217.2/202.0,10 V,25 eV和193.1/133.1，49

8、 V，25 eV，8-甲氧基5-羥基補(bǔ)骨脂素的檢測(cè)離子對(duì)和DP電壓、CE電壓為193.1/133.1，49 V，25 eV。色譜分離采用AgilentZorbax SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫:25℃;流動(dòng)相為甲醇(A)和1 mmol/L乙酸銨-水(B)，梯度洗脫，洗脫程序如下:0～5 min，從50％A線性變化至95％ A;5-8.5 min，保持95％A;流速:0.8 mL/min，進(jìn)樣量10μL。

9、
　　結(jié)果:1經(jīng)過考察確定的提取條件為:以正庚醇為萃取溶劑，中空纖維長(zhǎng)度為5 cm，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為675 rpm，萃取溫度為室溫，100μL血漿用2％ NaCl稀釋至1.5 mL，萃取時(shí)間為50 min;2實(shí)驗(yàn)得到歐前胡素和花椒毒酚的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和藥-時(shí)曲線。灌胃給予大鼠歐前胡素以后吸收迅速，在1.01 h達(dá)到最大濃度，T1/2為7.93，K為0.079(l/h)，說明歐前胡素消除亦較快。灌胃5 min以后即檢測(cè)到代謝物花椒毒酚

10、，說明歐前胡素被吸收以后迅速被轉(zhuǎn)化為代謝物花椒毒酚;3大鼠灌胃給予歐前胡素后，歐前胡素在尿中45 h內(nèi)基本排泄完全，在膽汁中16h內(nèi)基本排泄完全。歐前胡素以原型、花椒毒酚和花椒毒素的形式在尿液中的排泄量分別為13.46％，5.296％，和0.1686％;在膽汁中的排泄量分別為0.1214％，0.04282％和0.009042％。表明歐前胡素以原型在大鼠尿液和膽汁中排泄率不高。
　　結(jié)論:建立了一種環(huán)保、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的HPLC

11、-MS法測(cè)定大鼠血漿、尿液和膽汁中的歐前胡素及其代謝物。歐前胡素在大鼠體內(nèi)吸收迅速，主要經(jīng)尿液排泄。
　　第二部分異歐前胡素的藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:1建立大鼠血漿中異歐前胡素及其代謝物花椒毒酚的HPLC-MS測(cè)定方法，并研究大鼠灌胃給予異歐前胡素后的藥代動(dòng)力學(xué)特征;2建立大鼠尿液和膽汁中異歐前胡素及其代謝物花椒毒酚和花椒毒素的HPLC-MS測(cè)定方法，并研究大鼠灌胃給予異歐前胡素后的排泄動(dòng)力學(xué)特征。
　　方法:1將異

12、歐前胡素混懸在于CMC-Na的灌胃液給予大鼠后，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行眼內(nèi)眥取血，得到血漿生物樣本，采用HF-LPME的預(yù)處理方法，采用與第一部分血漿測(cè)定相同的液相和質(zhì)譜條件下進(jìn)行檢測(cè);26只SD大鼠灌胃給予異歐前胡素后置于代謝籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲水，4h后給予食物，分別收集0-4，4-8，8-12，12-24，24-36，36-48，48-60和60-72 h時(shí)間段的尿液并記錄體積，之后采用與第一部分尿液處理相同的方法進(jìn)行預(yù)處理。另取6只

13、大鼠給藥后，以20％烏拉坦麻醉（7mL/kg），進(jìn)行膽管插管術(shù)，收集給藥后0-2，2-4，4-8，8-12，12-20和20-24 h時(shí)間段的膽汁并記錄體積，收集的樣本使用乙酸乙酯萃取的方法進(jìn)行預(yù)處理，采用第一部分排泄動(dòng)力學(xué)部分的液相和質(zhì)譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示異歐前胡素吸收迅速，計(jì)算得到異歐前胡素的T1/2為2.78 h，K為0.249(l/h)說明異歐前胡素在大鼠體內(nèi)消除較快;2在尿液中，72 h內(nèi)異歐前胡

14、素原型在45 h內(nèi)基本排泄完全，代謝物則在56h內(nèi)基本排泄完全，異歐前胡素分別以原型和代謝物形式排泄量約占總給藥量的17.80％和12.34％。而在膽汁中，異歐前胡素以原型形式在12h內(nèi)基本排泄完全，而代謝物經(jīng)15 h基本排泄完全，兩種形式排泄量分別約占總給藥量的2.150％和0.0820％。
　　結(jié)論:異歐前胡素和歐前胡素在大鼠體內(nèi)的T1/2、 Cmax、Tmax和K無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，二者都吸收迅速，消除較快;在相同給藥量的前提