胞外基質(zhì)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞選擇分化的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、腱/韌帶是堅(jiān)韌的結(jié)締組織，通過其結(jié)構(gòu)、力學(xué)性質(zhì)和外形的變化以響應(yīng)外力的刺激，在運(yùn)動(dòng)中起著重要作用，但活動(dòng)范圍超過極限或拉扯過劇，腱/韌帶都會(huì)受到損傷甚至斷裂，嚴(yán)重影響人們的健康。腱/韌帶損傷的治療目前仍然是整形外科中具有挑戰(zhàn)性的問題，比如如何加快治療速度、提高治療質(zhì)量直至完全治愈等等，都是臨床上亟待解決的難題。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有增殖和多分化潛能的特殊細(xì)胞。在特異

2、誘導(dǎo)條件作用下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可增殖并定向分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等，這種分化可塑性為彌補(bǔ)臨床上腱/韌帶組織的缺乏和腱/韌帶創(chuàng)傷的愈合帶來了希望，但對(duì)于胞外基質(zhì)是否能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腱/韌帶成纖維細(xì)胞定向分化以及分化的適宜條件，至今尚沒有系統(tǒng)研究報(bào)道。為此，本文以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Rat marrow mesenchymal stem cells，rMSCs)為研究對(duì)象，采用肌腱細(xì)胞胞外基質(zhì)的主要成

3、分Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)和彈性蛋白(Elastin)分別對(duì)骨髓干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，考察了Collagen Ⅰ和Elastin誘導(dǎo)大鼠骨髓干細(xì)胞向腱/韌帶成纖維細(xì)胞定向分化的條件。主要研究工作和結(jié)果如下： 1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)利用密度梯度離心結(jié)合差異貼壁法進(jìn)行大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)，結(jié)果表明：1.073g/ml的percoll密度梯度離心結(jié)合差異貼壁分離得到的細(xì)胞為形態(tài)比較均一的單核細(xì)胞

4、，用含15％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞開始貼壁，繼而分裂增殖，呈集落式生長(zhǎng)，約2周后細(xì)胞接近融合，呈紡錘形或長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。其間有漂浮不貼壁的造血細(xì)胞等，在反復(fù)換液中被除去。傳代細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)較快，約一周可達(dá)到融合，呈長(zhǎng)梭形或紡錘形均勻分布。細(xì)胞核漿比較大，姬姆沙染色胞核呈圓形或橢圓形，為紫色，可見數(shù)個(gè)深紫色的核仁，胞漿為淡紫色。 2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

5、的鑒定和周期分析利用免疫染色方法考查了分離培養(yǎng)的細(xì)胞表面部分抗原的表達(dá)，利用流式細(xì)胞技術(shù)分析了細(xì)胞周期的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞表面抗原CD34(造血干細(xì)胞標(biāo)記物)呈陰性：CD44和CD29呈陽(yáng)性表達(dá)。細(xì)胞周期分析顯示G<,0>/G<,1>期細(xì)胞占(89.74±3.87)％，S期細(xì)胞占(2.49±2.2)％，G2/M期細(xì)胞占(7.7±3.7)％，表明大部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)。 3.Collagen Ⅰ對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的

6、誘導(dǎo)考查了不同濃度的Collagen Ⅰ對(duì)大鼠骨髓干細(xì)胞選擇分化的誘導(dǎo)作用，利用RT-PCR技術(shù)定量檢測(cè)了誘導(dǎo)7天、14天和21天過程中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和腱/韌帶成纖維細(xì)胞特異標(biāo)志基因Scleraxis mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果表明：不同濃度Collagen Ⅰ誘導(dǎo)細(xì)胞分化7天Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ都有不同程度的表達(dá)，而Sderaxis的表達(dá)并不明顯。誘導(dǎo)14天后Collagcn Ⅰ、Col

7、lagen Ⅲ和Scleraxis相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)一個(gè)峰值，21天后表達(dá)量又開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。比較而言，100μg/ml的Collagen Ⅰ誘導(dǎo)14天，Collagen Ⅰ、Collagcn Ⅲ和Sderaxis mRNA水平的表達(dá)呈現(xiàn)較高的水平。 4.Elastin對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)采取同樣的方法考查了不同濃度的Elastin對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞選擇分化的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明： Elasfin刺激rMSCs

8、7天后Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ有少量表達(dá)。與Colleen Ⅰ誘導(dǎo)有所不同的是，作用7天后Sderaxis就開始表達(dá)，作用14天后各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大，作用21天后表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。20μg/mL Elastin的誘導(dǎo)效果相對(duì)較好，作用效果更為明顯。 本文研究結(jié)果表明，胞外基質(zhì)Collagen Ⅰ和Elastin對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的選擇分化起著重要的調(diào)節(jié)作用，在適宜條件下可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腱/韌