HO-1增強(qiáng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性及其免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:(1)探討血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BM MSCs)自身活性的影響。(2)探討HO-1基因修飾的BM MSCs(HO-1/MSCs)在體外對(duì)淋巴細(xì)胞的影響及其機(jī)制。
　　方法:(1)選用4-5周齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，處死消毒后取其長(zhǎng)骨，用含10％胎牛血清(fetal bovine serum

2、，F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)并擴(kuò)增BM MSCs。倒置顯微鏡下觀察BM MSCs細(xì)胞形態(tài)，熒光標(biāo)記抗體與細(xì)胞孵育后，流式細(xì)胞術(shù)鑒定第3代細(xì)胞的表型，并檢測(cè)其誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的能力。(2)用載有HO-1基因的重組腺病毒載體感染BM MSCs，形成HO-1/BM MSCs，在熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染率。提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法和

3、Western印跡法分析細(xì)胞內(nèi)HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平并計(jì)算HO-1的表達(dá)差異。(3)將第3代BM MSCs和HO-1/BM MSCs接種在E-Plate電極板中，用含10％ FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)至貼壁后，更換為低血清(2％ FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)液，并用二氯化鈷(CoC12)處理細(xì)胞12小時(shí)，建立缺血缺氧的環(huán)境。采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀分析細(xì)胞生長(zhǎng)速度，繪制生長(zhǎng)曲線，并用AnnexinⅤ/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

4、。(4)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng):將HO-1/BMMSCs及對(duì)照組GFP/BM MSCs與大鼠脾淋巴細(xì)胞、刀豆蛋白(Concanavalin，ConA)建立共培養(yǎng)體系，混合培養(yǎng)0h、24h和48h后，用MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖活性，碘化丙啶染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的分布情況，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子含量，流式細(xì)胞術(shù)分析T淋巴細(xì)胞亞群及其活化標(biāo)志CD25、CD71的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)體外成功培養(yǎng)和擴(kuò)增出大鼠BM MSCs。細(xì)胞貼壁

5、生長(zhǎng)，傳代后的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，部分呈漩渦或菊花狀排列，具備典型的MSCs形態(tài)特征。細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)顯示，CD29、CD90和RT1A均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為99.49％、90.12％和98.99％;而CD34、CD45和RT1B均為陰性，陰性率均＞95％。細(xì)胞能夠誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞（油紅O染色示胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴）和成骨細(xì)胞(von Kossa染色示細(xì)胞中出現(xiàn)黑色鈣鹽)。(2)用表達(dá)HO-1基因的重組腺病毒感染BM MSCs48h后，熒光

6、顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)陽(yáng)性率＞80％。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HO-1基因表達(dá)明顯上調(diào)，表達(dá)量約為對(duì)照細(xì)胞的5倍。Western印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HO-1/BM MSCs中HO-1蛋白的表達(dá)量明顯提高。(3)生長(zhǎng)曲線顯示，在正常培養(yǎng)條件下，載有HO-1基因的腺病毒感染對(duì)BM MSCs增殖沒(méi)有明顯的影響。但在缺血缺氧條件下，HO-1/MSCs的增殖活性明顯強(qiáng)于對(duì)照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下

7、，HO-1/BM MSCs組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率均很低，但在缺血缺氧條件下，HO-1/BMMSCs組凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯低于對(duì)照組。(4) HO-1/BM MSCs參與共培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞周期進(jìn)程均被抑制，促炎因子(IL-2、TNF-α和IFN-γ)的分泌量降低、抗炎因子(IL-10)的分泌量升高，T淋巴細(xì)胞亞群分化比例降低，同時(shí)T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志CD25和CD71的表達(dá)降低，與BM MSCs組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)