胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子及機(jī)械刺激對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、干細(xì)胞（Stem cells）是一種具有自我更新和多向分化潛能的特殊細(xì)胞，依其分化能力的不同可分為全能干細(xì)胞（Totipotent stem cell，TSC）、多能干細(xì)胞（Pluripotential stem cell，PSC）和單能干細(xì)胞（Unipotent stem cell，USC）三類。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潛能，在

2、特定誘導(dǎo)條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，是目前研究、應(yīng)用最多的干細(xì)胞類型，已成為臨床細(xì)胞移植治療和組織工程的主要細(xì)胞來(lái)源。但 MSCs在體外生長(zhǎng)緩慢、增殖能力有限，因此如何促進(jìn)MSCs的體外增殖并保持其多向分化潛能是廣泛研究和臨床應(yīng)用的前提。
　　已有研究證明，細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）、細(xì)胞因子（Cytokine）和機(jī)械刺激（Mechanical stimulation

3、）等理化因素對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖起著重要的調(diào)節(jié)作用。I型膠原（Type I collagen，Col I）是ECM的主要成分之一，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有明顯的促進(jìn)作用，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激也能顯著促進(jìn)細(xì)胞的體外增殖。但Col I、bFGF和機(jī)械刺激及其聯(lián)合作用對(duì)MSCs生長(zhǎng)和增殖的影響尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。為此，本文以大鼠MSCs（Rat MSCs，r

4、MSCs）為實(shí)驗(yàn)材料，采用MTT法考察Col I、bFGF和機(jī)械拉伸等理化因素及其聯(lián)合作用對(duì)rMSCs體外生長(zhǎng)和增殖的影響，尋找在體外促進(jìn)rMSCs生長(zhǎng)和增殖的適宜理化刺激條件。主要研究工作和結(jié)果如下：
　　1. rMSCs的原代分離培養(yǎng)
　　利用密度梯度離心結(jié)合差異貼壁法進(jìn)行rMSCs的原代分離培養(yǎng)，結(jié)果表明：1.073 g/mL的percoll密度梯度離心結(jié)合差異貼壁分離得到的細(xì)胞為形態(tài)比較均一的單核細(xì)胞，用含10％胎牛

5、血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，繼而分裂增殖，呈集落式生長(zhǎng)，約2周后接近融合，呈紡錘形或長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。其間有漂浮不貼壁的造血細(xì)胞等雜細(xì)胞，在反復(fù)換液中被除去。傳代后細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)較快，約一周可達(dá)到融合，呈長(zhǎng)梭形或紡錘形均勻分布。
　　2. rMSCs的鑒定和周期分析
　　姬姆沙染色顯示培養(yǎng)細(xì)胞胞核呈圓形或橢圓形，為紫色，可見(jiàn)數(shù)個(gè)深紫色的核仁，胞漿為淡

6、紫色。利用免疫染色方法考察培養(yǎng)細(xì)胞表面部分抗原的表達(dá)，以及流式細(xì)胞技術(shù)分析了細(xì)胞周期的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞表面抗原CD34（造血干細(xì)胞標(biāo)記物）呈陰性，CD44和CD29呈陽(yáng)性表達(dá)。細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期細(xì)胞占（89.74±3.87）%，S期細(xì)胞占（2.49±2.20）%，G2/M期細(xì)胞占（7.70±3.70）%，表明大部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)。
　　3. Col I和bFGF及其聯(lián)合作用對(duì)rMSCs增殖的影響
　　本文首

7、先測(cè)定了rMSCs的生長(zhǎng)曲線，然后考察了Col I和bFGF單獨(dú)和聯(lián)合作用對(duì)rMSCs增殖的影響。結(jié)果表明：第1~2天為rMSCs生長(zhǎng)潛伏期，第3~7天為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，7天以后細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。在0-40μg/mL的研究濃度范圍內(nèi)，Col I裱襯均能顯著促進(jìn)rMSCs的增殖，20μg/mL的Col I裱襯增殖效果相對(duì)更好。時(shí)間依賴實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20μg/mL Col I裱襯培養(yǎng)8天，最有利于rMSCs增殖。在0-20 ng/mL的研究濃度范

8、圍內(nèi)，bFGF都能促進(jìn)rMSCs增殖，7 ng/mL bFGF誘導(dǎo)的增殖效果相對(duì)更好。7 ng/mL bFGF誘導(dǎo)培養(yǎng)8天，為rMSCs增殖的最佳條件。Col I裱襯和bFGF聯(lián)合作用顯示，聯(lián)合作用的促rMSCs增殖效果高于單因素作用的效果，表明二者對(duì)rMSCs增殖具有協(xié)同促進(jìn)作用。
　　4.機(jī)械拉伸以及與Col I、bFGF聯(lián)合作用對(duì)rMSCs增殖的影響
　　本文應(yīng)用細(xì)胞拉伸加載裝置，考察了1 Hz下不同應(yīng)變大小（5%和1

9、0%應(yīng)變）、不同作用時(shí)間（15分鐘、30分鐘和60分鐘）的拉伸作用rMSCs，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，5%應(yīng)變組15分鐘和60分鐘的拉伸加載能促進(jìn)rMSCs的增殖，而且15分鐘加載的增殖效果好于60分鐘加載，30分鐘拉伸對(duì)rMSCs增殖卻表現(xiàn)出抑制作用。10%應(yīng)變組的拉伸結(jié)果與5%應(yīng)變組類似，但誘導(dǎo)的增殖效果優(yōu)于5%應(yīng)變組。結(jié)果證明1 Hz10%應(yīng)變加載15分鐘是促進(jìn) rMSCs體外增殖的適宜拉伸條件