胞外基質、細胞因子及機械刺激對大鼠骨髓間充質干細胞增殖的調節(jié)作用.pdf

1、干細胞（Stem cells）是一種具有自我更新和多向分化潛能的特殊細胞，依其分化能力的不同可分為全能干細胞（Totipotent stem cell，TSC）、多能干細胞（Pluripotential stem cell，PSC）和單能干細胞（Unipotent stem cell，USC）三類。骨髓來源的間充質干細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潛能，在

2、特定誘導條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等，是目前研究、應用最多的干細胞類型，已成為臨床細胞移植治療和組織工程的主要細胞來源。但 MSCs在體外生長緩慢、增殖能力有限，因此如何促進MSCs的體外增殖并保持其多向分化潛能是廣泛研究和臨床應用的前提。
　　已有研究證明，細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）、細胞因子（Cytokine）和機械刺激（Mechanical stimulation

3、）等理化因素對細胞的生長和增殖起著重要的調節(jié)作用。I型膠原（Type I collagen，Col I）是ECM的主要成分之一，堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）對多種細胞的生長和增殖具有明顯的促進作用，適當的機械刺激也能顯著促進細胞的體外增殖。但Col I、bFGF和機械刺激及其聯合作用對MSCs生長和增殖的影響尚未見詳細報道。為此，本文以大鼠MSCs（Rat MSCs，r

4、MSCs）為實驗材料，采用MTT法考察Col I、bFGF和機械拉伸等理化因素及其聯合作用對rMSCs體外生長和增殖的影響，尋找在體外促進rMSCs生長和增殖的適宜理化刺激條件。主要研究工作和結果如下：
　　1. rMSCs的原代分離培養(yǎng)
　　利用密度梯度離心結合差異貼壁法進行rMSCs的原代分離培養(yǎng)，結果表明：1.073 g/mL的percoll密度梯度離心結合差異貼壁分離得到的細胞為形態(tài)比較均一的單核細胞，用含10％胎牛

5、血清（Fetal bovine serum，FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后細胞開始貼壁，繼而分裂增殖，呈集落式生長，約2周后接近融合，呈紡錘形或長梭形的成纖維細胞樣形態(tài)。其間有漂浮不貼壁的造血細胞等雜細胞，在反復換液中被除去。傳代后細胞貼壁、生長較快，約一周可達到融合，呈長梭形或紡錘形均勻分布。
　　2. rMSCs的鑒定和周期分析
　　姬姆沙染色顯示培養(yǎng)細胞胞核呈圓形或橢圓形，為紫色，可見數個深紫色的核仁，胞漿為淡

6、紫色。利用免疫染色方法考察培養(yǎng)細胞表面部分抗原的表達，以及流式細胞技術分析了細胞周期的分布。結果發(fā)現：細胞表面抗原CD34（造血干細胞標記物）呈陰性，CD44和CD29呈陽性表達。細胞周期分析顯示G0/G1期細胞占（89.74±3.87）%，S期細胞占（2.49±2.20）%，G2/M期細胞占（7.70±3.70）%，表明大部分細胞處于非增殖狀態(tài)。
　　3. Col I和bFGF及其聯合作用對rMSCs增殖的影響
　　本文首

7、先測定了rMSCs的生長曲線，然后考察了Col I和bFGF單獨和聯合作用對rMSCs增殖的影響。結果表明：第1~2天為rMSCs生長潛伏期，第3~7天為對數增長期，7天以后細胞的生長進入平臺期。在0-40μg/mL的研究濃度范圍內，Col I裱襯均能顯著促進rMSCs的增殖，20μg/mL的Col I裱襯增殖效果相對更好。時間依賴實驗發(fā)現20μg/mL Col I裱襯培養(yǎng)8天，最有利于rMSCs增殖。在0-20 ng/mL的研究濃度范

8、圍內，bFGF都能促進rMSCs增殖，7 ng/mL bFGF誘導的增殖效果相對更好。7 ng/mL bFGF誘導培養(yǎng)8天，為rMSCs增殖的最佳條件。Col I裱襯和bFGF聯合作用顯示，聯合作用的促rMSCs增殖效果高于單因素作用的效果，表明二者對rMSCs增殖具有協同促進作用。
　　4.機械拉伸以及與Col I、bFGF聯合作用對rMSCs增殖的影響
　　本文應用細胞拉伸加載裝置，考察了1 Hz下不同應變大?。?%和1

9、0%應變）、不同作用時間（15分鐘、30分鐘和60分鐘）的拉伸作用rMSCs，繼續(xù)培養(yǎng)6小時后測定細胞的增殖情況。結果表明：與對照組比較，5%應變組15分鐘和60分鐘的拉伸加載能促進rMSCs的增殖，而且15分鐘加載的增殖效果好于60分鐘加載，30分鐘拉伸對rMSCs增殖卻表現出抑制作用。10%應變組的拉伸結果與5%應變組類似，但誘導的增殖效果優(yōu)于5%應變組。結果證明1 Hz10%應變加載15分鐘是促進 rMSCs體外增殖的適宜拉伸條件