中藥對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景自身免疫病(Autoimmunitydisease，AID)屬于難治性疾病，嚴(yán)重危害著人類健康，目前尚無滿意的治療藥物。長期以來，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)施的標(biāo)準(zhǔn)治療是激素非特異性免疫抑制療法，療效雖已被證實(shí)，但只能改善癥狀，不能有效地從根本上控制疾病的發(fā)生和發(fā)展，且毒性、副作用大，不能長期持續(xù)應(yīng)用。故急需尋找開發(fā)高效、低毒乃至無毒的免疫調(diào)節(jié)藥物。中醫(yī)藥學(xué)的臨床實(shí)踐表明，大量天然藥物及其植物來源的單體或有效部位對自身免疫病具有一定的預(yù)防、治療

2、作用，中藥免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用具有毒副作用小、療效好等特點(diǎn)，日益廣泛地應(yīng)用于臨床，因而成為自身免疫病藥物開發(fā)的一個新領(lǐng)域。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，MSCs)是一種存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力。研究發(fā)現(xiàn)MSCs除具有支持造血，促進(jìn)體內(nèi)造血功能重建外，在骨髓移植中還具有抑制移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVH

3、D)的作用，表明MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能。有關(guān)MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)理，目前認(rèn)為主要與其抑制T淋巴細(xì)胞對刺激的反應(yīng)性有關(guān)。因MSCs具有免疫調(diào)節(jié)的功能，故在治療自身免疫病和誘導(dǎo)移植耐受中有著廣泛的應(yīng)用前景。白體或異體骨髓移植已經(jīng)證實(shí)在治療自身免疫病中有確切的療效，骨髓干細(xì)胞移植己成為治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病的一種新的思路。 中醫(yī)療法強(qiáng)調(diào)通過調(diào)動或調(diào)整機(jī)體的內(nèi)在機(jī)制(自穩(wěn)調(diào)節(jié)機(jī)制)以恢復(fù)機(jī)體自我調(diào)節(jié)能力。因此研究中藥對MSC

4、s免疫調(diào)節(jié)作用的影響，維護(hù)機(jī)體內(nèi)源性正常的免疫調(diào)節(jié)行為，可能是中醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)作用研究的一個理想的模型。本文通過觀察中藥對MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究，探索中藥免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)理，合理評價中藥的免疫調(diào)節(jié)作用。 研究方法及結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)以PHA、PMA、ConA、LPS刺激大鼠淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)體系，觀察SD大鼠MSCs(ratMSCs，rMSCs)對淋巴細(xì)胞體外活化增殖的影響。進(jìn)一步明確rMSCs是否具有抑制淋巴細(xì)胞對

5、刺激反應(yīng)性的作用，通過RT-PCR、ELISA方法，初步探討其作用的可能機(jī)理。在此基礎(chǔ)上，觀察中藥有效部位或單體對rMSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖作用的影響，借此研究中藥免疫調(diào)節(jié)作用的可能機(jī)理。 1、rMSCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 以SD大鼠為供體，股骨、脛骨離斷，白骨髓腔內(nèi)獲取骨髓標(biāo)本，采用直接貼壁法培養(yǎng)，原代細(xì)胞以L-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代細(xì)胞以條件培養(yǎng)液培養(yǎng)。對rMSCs生物學(xué)特性進(jìn)行研究，并采用誘導(dǎo)分化、免疫細(xì)胞化

6、學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定。在本實(shí)驗(yàn)的體外培養(yǎng)條件下，rMSCs經(jīng)歷了生長緩滯期、對數(shù)生長期和平臺期。傳代后細(xì)胞生長速度明顯增快，原代培養(yǎng)需要8～10d，而傳代細(xì)胞僅需要4～6d即可再次傳代。傳5代后，MSCs數(shù)可增加至1×108個以上。從貼壁時間的測定實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，傳代后細(xì)胞能在較短的時間內(nèi)貼壁，10h貼壁率達(dá)到95％以上，其接種成活率高，所以實(shí)現(xiàn)體外大量擴(kuò)增rMSCs是可能的，本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡單、有效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的分離rMSCs的體外培養(yǎng)方

7、法。 2、PHA、PMA、ConA及LPS對淋巴細(xì)胞增殖合適濃度、以及淋巴細(xì)胞密度的確定 通過對不同終濃度PHA、PMA、ConA、或LPS，不同細(xì)胞濃度的淋巴細(xì)胞，進(jìn)行大鼠淋巴細(xì)胞活化增殖實(shí)驗(yàn)，確定PHA、PMA、ConA和LPS的合適終濃度以及淋巴細(xì)胞接種密度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明淋巴細(xì)胞接種濃度為6×106個/ml，PHA、PMA、ConA、LPS終濃度分別為40、1、5、20μg/ml時，淋巴細(xì)胞刺激增殖的

8、效果最好。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用該濃度的淋巴細(xì)胞以及上述刺激劑的刺激濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3、rMSC對異體淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用 rMSCs以不同密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，將大鼠脾臟或外周血淋巴細(xì)胞接種于MSCs滋養(yǎng)層之上，加入PHA、PMA、ConA或LPS刺激淋巴細(xì)胞活化增殖。作用72h后，以CCK-8試劑盒測定淋巴細(xì)胞增殖，計(jì)算rMSCs對不同刺激劑作用下淋巴細(xì)胞增殖抑制率，觀察rMSCs對淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。在實(shí)驗(yàn)中，同

9、時觀察MSCs不同濃度培養(yǎng)上清液對淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。 研究結(jié)果顯示，不同濃度滋養(yǎng)層的rMSCs，對由PHA、PMA、ConA刺激引起的淋巴細(xì)胞活化增殖均有不同程度的抑制作用，其抑制作用強(qiáng)度與rMSCs的數(shù)量成正相關(guān)，而對LPS引起的淋巴細(xì)胞增殖無抑制作用。不同濃度的rMSCs培養(yǎng)上清液對PHA、PMA及ConA引起的淋巴細(xì)胞活化增殖也有一定程度的抑制作用，且與其濃度亦呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系。 4、中藥對rMSC抑制淋

10、巴細(xì)胞增殖作用的干預(yù) rMSCs經(jīng)中藥預(yù)處理24h，吸盡培養(yǎng)液后加入淋巴細(xì)胞懸液，以及PHA、PMA或ConA刺激劑，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，測定淋巴細(xì)胞增殖抑制率，觀察經(jīng)不同中藥預(yù)處理后的rMSCs對淋巴細(xì)胞增殖抑制作用是否發(fā)生改變。 所選中藥中，部分對rMSCs的免疫抑制作用確有影響，經(jīng)預(yù)處理的rMSCs，對淋巴細(xì)胞的增殖抑制影響發(fā)生一定程度的改變。其中黃芪甲苷處理后的rMSCs及其培養(yǎng)上清液，對rMSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖

11、作用有一定程度減弱作用；而槲皮素、姜黃素、Q-C處理后的rMSCs對淋巴細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)。 5、中藥對rMSC抑制淋巴細(xì)胞增殖作用干預(yù)機(jī)制的初步研究 采用RT-PCR方法檢測rMSCsTGF-β1、IFN-γmRNA，同時檢測與MSCs共培養(yǎng)后的淋巴細(xì)胞IL-10mRNA，借此說明rMSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖的機(jī)理，同時檢測中藥處理后上述mRNA是否改變，以此推測中藥對rMSCs免疫抑制作用的干預(yù)機(jī)制。 采用E

12、LISA法檢測rMSCs培養(yǎng)上清液中TGF-β1的含量，推測rMSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖是否與其所分泌的TGF-β1有關(guān)，同時檢測淋巴細(xì)胞與rMSCs共培養(yǎng)體系分泌IL-10是否改變，推測rMSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖是否與共培養(yǎng)體系中抑制性細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。檢測經(jīng)過中藥預(yù)處理后，上述細(xì)胞因子的表達(dá)是否發(fā)生改變，研究中藥對rMSCs免疫調(diào)節(jié)作用的干預(yù)作用可能機(jī)理。 RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，rMSCs表達(dá)TGF-β1mRNA，不表達(dá)IF

13、N-γmRNA，經(jīng)黃芪甲苷處理的rMSCs，TGF-β1mRNA的表達(dá)量有所下降，而經(jīng)與槲皮素、姜黃素以及Q-C處理后TGF-β1mRNA的表達(dá)增強(qiáng)。淋巴細(xì)胞本身表達(dá)較弱的IL-10mRNA；未經(jīng)中藥處理的rMSCs使淋巴細(xì)胞IL-10mRNA表達(dá)增加；黃芪甲苷處理rMSCs后使淋巴細(xì)胞IL-10mRNA表達(dá)高于單純淋巴細(xì)胞而低于未經(jīng)處理的rMSCs；而槲皮素、姜黃素以及Q-C則與之相反。 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥對rMSC