解偶聯(lián)蛋白3在抗心臟缺血-再灌注損傷中的作用和機制.pdf

1、目的：
　　心肌梗塞后及時再灌注是挽救缺血心肌必需的步驟，但該過程伴隨著嚴重的再灌注損傷。缺血/再灌注造成的線粒體Ca2+（[Ca2+]m）超載和活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量釋放并導(dǎo)致線粒體嚴重的結(jié)構(gòu)和功能破壞，是心肌細胞缺血/再灌注損傷的主要原因。因此尋找保護線粒體的關(guān)鍵靶點，對于深入理解缺血/再灌注導(dǎo)致心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷機制，進而提出心肌保護的新策略至關(guān)重要。ROS不僅參與細胞損傷，

2、適量ROS通過激活細胞保護信號通路介導(dǎo)缺血預(yù)處理/后處理的抗心肌缺血/再灌注損傷的保護作用。線粒體是調(diào)控心肌細胞活性氧產(chǎn)生、Ca2+穩(wěn)態(tài)和收縮功能的重要細胞器之一。在缺血/再灌注過程中過度釋放的活性氧以及線粒體 Ca2+超載都被證明可以打開線粒體膜通透性通道(mitochondrial permeability transition pores,MPTP)，進而造成心肌細胞的凋亡和壞死。因此理解和闡明在缺血/再灌注過程中線粒體ROS大量

3、釋放與Ca2+超載的發(fā)生原因以及 MPTP的分子調(diào)控機制對于找到有效的心肌保護措施是至關(guān)重要的。線粒體解偶聯(lián)蛋白（mitochondrial uncoupling proteins，UCPs）位于線粒體內(nèi)膜上，UCPs通過降低ROS的產(chǎn)生以及保護線粒體功能來保護心臟抵抗缺血/再灌注損傷造成的心臟功能紊亂，但是UCP3如何影響線粒體的活性氧的釋放、[Ca2+]m穩(wěn)態(tài)以及MPTP的開放及其分子機制目前都不清楚。因此，本研究旨在闡明如下問題：

4、1）UCP3在過氧化氫預(yù)處理(hydrogen peroxide preconditioning，H2O2PC)保護模型中的作用；2）UCP3對[Ca2+]m超載，線粒體 ROS釋放以及MPTP開放的作用；3）UCP3與MPTP組分的關(guān)系及作用機制；4）保護性信號通路在UCP3心肌保護中的作用。
　　方法：
　　雄性SD大鼠（280-320克）隨機分為對照組和H2O2PC組，利用Langendorff灌流模型，進行30分鐘缺

5、血繼之45分鐘再灌注，觀察記錄心功能指標(biāo)的變化。收取缺血前、缺血后和再灌注后左心室心肌組織，利用western blot和QPCR的方法檢測心肌組織中UCP3基因和蛋白表達量。分別構(gòu)建UCP3下調(diào)(AdshUCP3)和UCP3過表達(AdUCP3)腺病毒載體并感染大鼠心臟和原代分離的心肌細胞，檢測缺血/再灌注過程中心臟收縮舒張功能和心肌壞死以及心肌細胞收縮功能和鈣瞬變，評價UCP3對缺血/再灌注過程中心臟/心肌細胞收縮功能和心肌細胞存活

6、的影響以及其在H2O2PC保護模型中的作用。為研究UCP3對缺血/再灌注過程中心肌細胞線粒體功能的影響，我們利用心肌細胞模擬缺血（20分鐘）/再灌注(30分鐘)模型，用Rhod-2、MitoSOX和TMRE熒光染料分別實時監(jiān)測線粒體[Ca2+]m超載、線粒體ROS的釋放和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,ΔΨm）的變化。采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP

7、）方法分析UCP3蛋白與MPTP蛋白組分的相互作用。進一步利用western blot方法研究UCP3在心肌缺血/再灌注損傷及其保護中對保護性信號通路的影響。利用特異開放劑或抑制劑分析MPTP和PI3K/Akt信號通路在UCP3心肌保護中的重要作用及其調(diào)控方式。
　　結(jié)果：
　　H2O2PC顯著改善大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷后左心室收縮舒張功能恢復(fù)及冠脈流量并降低心肌梗死面積。QPCR及western blot結(jié)果顯示H2

8、O2PC明顯增加UCP3基因和蛋白表達量。AdshUCP3和AdUCP3腺病毒分別過表達和下調(diào)UCP3表達水平證實UCP3高表達介導(dǎo)并且模擬H2O2PC對抗心肌缺血/再灌注造成的心臟/心肌細胞收縮舒張功能損傷以及心肌梗死，而單獨下調(diào)UCP3的表達并不改變正常及缺血/再灌注過程中心臟和心肌細胞的收縮舒張功能。UCP3介導(dǎo)并能模擬H2O2PC降低缺血/再灌注損傷造成的[Ca2+]m超載、線粒體ROS大量釋放以及ΔΨm的喪失。Co-IP結(jié)果分

9、析表明UCP3與MPTP的蛋白組分之一ANT相互作用，而不是其他組分。Western blot結(jié)果顯示，UCP3下調(diào)取消由于缺血/再灌注造成的心肌細胞中內(nèi)源保護信號蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）和糖原合成酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）磷酸化水平的升高。并且，UCP3能介導(dǎo)和模擬H2O2PC升高缺血/再灌注過程中Akt和GSK-3β磷酸化水平的影響。進而，我們利用L

10、angendorff灌流和離體心肌細胞模型研究 MPTP和PI3K/Akt/GSK-3β信號通路在H2O2PC和UCP3的心肌保護中的作用。應(yīng)用MPTP直接開放劑atractyloside（ATR）完全取消H2O2PC和UCP3過表達對心臟/心肌細胞收縮功能以及心肌梗死的保護作用，而PI3K的抑制劑wortmannin只能部分取消H2O2PC和UCP3過表達的保護作用。
　　結(jié)論：以上結(jié)果表明，H2O2PC顯著升高心肌內(nèi)UCP3的

11、表達，而UCP3介導(dǎo)和模擬H2O2PC在缺血/再灌注過程中改善心功能回復(fù)、降低心肌梗死面積、降低[Ca2+]m超載、抑制線粒體 ROS大量釋放及防止ΔΨm喪失的作用。H2O2PC和UCP3過表達一方面通過UCP3直接與MPTP通道蛋白ANT相互作用而抑制MPTP的開放起到保護作用，另一方面可以啟動保護性信號通路PI3K/Akt/GSK-3β。MPTP在H2O2PC和UCP3的抗心肌缺血/再灌注損傷的保護作用起決定性作用，而PI3K/Ak