XBP1s在炎癥誘導腹膜纖維化形成中的作用.pdf

1、【背景】
　　腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是終末期腎病(End Stage Renal Disease,ESRD)患者腎臟替代治療的主要方法之一,這基于腹膜作為半透膜具有超濾和彌散的功能。腹膜長期暴露于生物不相容的腹膜透析液(peritoneal dialysis fluid,PDF)、反復發(fā)作的腹膜炎以及腹腔積血,都會造成腹膜的炎癥和損傷。長期的腹膜炎癥促使腹膜間皮細胞表型改變、新血管生成增加、細胞外

2、基質沉積和炎細胞浸潤,使腹膜處于高轉運狀態(tài),最終導致腹膜纖維化。這些改變與小分子溶質的轉運率以及腹膜功能超濾衰竭密切相關?；|沉積和炎性細胞因子的分泌被認為是引起腹膜結構和功能改變的主要原因之一。腹膜間皮細胞對腹膜改變、尤其是炎癥導致的腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展過程起重要作用。以白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)等炎癥因子、細胞因子及某些生長因子表達增加為特征的復雜的炎

3、癥反應過程是導致腹膜透析患者腹膜纖維化,最終導致腹膜失功的中心環(huán)節(jié)。
　　轉錄因子剪接型X盒結合蛋白1(X-Box Binding Protein1 spliced,XBP1s)是非折疊蛋白反應/內質網(wǎng)應激(Unfolded protein response,UPR/endoplasmic reticulum stress,ER stress)的重要通路蛋白之一,通過調控包括核因子κB(Nucleus Factor-κB,NF-κ

4、B)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)、活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)等多條途徑?jīng)Q定著炎癥的發(fā)生發(fā)展及轉歸。已證明,XBP1s可以通過ER stress通路介導c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)相關的炎癥因子IL-6分泌。也可以直接促發(fā)Toll樣受體(Toll Like Receptor,TL

5、R)介導的炎癥反應,導致炎癥因子IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)的大量分泌。在內質網(wǎng)應激和炎癥反應中,XBP1s作為關鍵分子起重要調節(jié)作用。
　　本研究通過體外和體內實驗初步驗證XBP1s在炎癥誘導的腹膜纖維化形成過程中的重要作用及部分機制,為炎癥導致腹膜纖維化尋找出了新的決定性分子,可能為未來通過干預炎癥來防治腹膜透析相關性腹膜纖維化尋找出藥物或基因治療的靶分子。

6、>　　【目的】
　　1)探討XBP1s與腹膜間皮細胞炎癥反應的關系;
　　2)驗證XBP1s抑制劑對CG誘導的腹膜炎大鼠腹膜纖維化的作用。
　　【方法】
　　1)收集和培養(yǎng)接受連續(xù)不臥床腹膜透析(Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis,CAPD)治療的ESRD患者腹膜透析流出液細胞,Western blotting檢測細胞中XBP1s蛋白表達,Real-time PCR

7、檢測腹膜透析流出液細胞中XBP1s和IL-1βmRNA表達;
　　2)不同濃度IL-1β刺激人腹膜間皮細胞(Human Peritoneal Mesothelial Cells,HPMC)24h,Real-time PCR檢測XBP1s、XBP1t mRNA表達;
　　3)以篩選出的IL-1β濃度刺激HPMC不同時間,Western blotting和Real-time PCR檢測XBP1s蛋白及mRNA表達,Real-ti

8、me PCR檢測IL-1βmRNA表達,ELISA檢測IL-6表達,Western blotting檢測Fibronectin的表達變化;
　　4)XBP1s抑制劑(STF083010)處理IL-1β誘導的HPMC,Western blotting方法檢測XBP1s的表達,Real-time PCR檢測IL-1βmRNA的表達,ELISA檢測IL-6的表達,Western blotting檢測Fibronectin的表達變化;

9、r>　　5)XBP1s抑制劑與IL-1β聯(lián)合刺激HPMC后,Western blotting檢測JNK和P-JNK表達;
　　6)建立急性腹膜炎誘發(fā)大鼠腹膜纖維化的模型,模型組腹腔注射0.05％葡萄糖酸氯己定(Chlorhexidine Gluconate,CG),抑制劑組腹腔注射CG和XBP1s抑制劑,對照組注射含10%乙醇的生理鹽水,2周后麻醉處死;
　　7)H-E和masson染色觀察各組大鼠壁層腹膜組織結構;West

10、ern blotting檢測XBP1s的表達變化;免疫組化法檢測XBP1、F4/80、α-SMA和CD31的表達變化。
　　【結果】
　　1)不同透齡的ESRD患者腹膜透析流出液細胞 XBP1s蛋白表達存在差異;XBP1s mRNA的相對表達量和腹膜透析時間呈正相關,與IL-1β的表達呈正相關。
　　2)不同濃度IL-1β處理HPMC24小時,XBP1s和XBP1t mRNA表達增加,二者比值增加,2ng/ml濃度時增

11、高最明顯;2ng/ml濃度IL-1β處理HPMC不同時間,XBP1s蛋白和mRNA表達增加,提示XBP1s在IL-1β誘導HPMC的表達變化存在劑量和時間依賴性;
　　3)IL-1β處理HPMC不同時間,IL-1βmRNA和IL-6蛋白表達增加,Fibronectin表達增加;
　　4)XBP1s抑制劑降低IL-1β誘導的HPMC中IL-1β mRNA和IL-6蛋白表達,下調Fibronectin的表達;
　　5)XB

12、P1s抑制劑顯著抑制IL-1β誘導的HPMC中JNK的磷酸化活化,而對總JNK表達無明顯影響。
　　6)與對照組相比,H-E和masson染色發(fā)現(xiàn)模型組腹膜明顯增厚和基質積聚,而XBP1s抑制劑部分抑制了大鼠模型的腹膜纖維化程度;
　　7)與對照組相比,模型組腹膜組織 XBP1s蛋白表達增加;與模型組比較,抑制劑組XBP1s蛋白表達下降;免疫組化結果顯示,模型組XBP1、F4/80、α-SMA及CD31增加。與模型組比較,X