皰疹病毒參與肺氣腫合并肺纖維化形成的研究.pdf

1、第一部分:MHV-68體外對(duì)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)化的確切影響
　　【目的】觀察MHV-68體外對(duì)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)化的確切影響,為我們的后期研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　【方法】A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為四大組,分別為A組:空白對(duì)照組;B組:MHV-68干預(yù)組;C組:TGF-β1陽(yáng)性對(duì)照組,D組:RSV干預(yù)組。每一組都設(shè)24h,48h,72h,96h四個(gè)亞組。運(yùn)用相差顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白E-

2、cadherin,α-SMA在細(xì)胞里的表達(dá)情況,Westernblot法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin,α-SMA在蛋白水平中的表達(dá)情況。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)水平。
　　【結(jié)果】顯微鏡鏡下觀察MHV-68干預(yù)組的A549細(xì)胞在干預(yù)后48h出現(xiàn)形態(tài)變化,在72h時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化更為顯著,表現(xiàn)為細(xì)長(zhǎng)梭型,并出現(xiàn)分叉,細(xì)胞間連接疏松。而空白對(duì)照組的A549呈典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞間連接緊密

3、,鏡下呈鵝卵石樣生長(zhǎng)。細(xì)胞免疫熒光顯示上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin在MHV-68干預(yù)72h后明顯減少,而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA在MHV-68干預(yù)后72h明顯增加(P<0.05)。Westernblot結(jié)果與細(xì)胞免疫熒光結(jié)果一致。ELISA結(jié)果顯示MHV-68干預(yù)組的培養(yǎng)基上清中TGF-β1的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增加(P<0.05)。同時(shí),RSV干預(yù)組與空白對(duì)照組間的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異。
　　【結(jié)論】MHV-68體

4、外可以誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549出現(xiàn)EMT樣改變,其可能機(jī)制與MHV-68促A549細(xì)胞分泌TGF-β1增多有關(guān),與之對(duì)照的RSV體外不能誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　第二部分:首創(chuàng)MHV-68干預(yù)老年吸煙小鼠所致CPFE模型
　　【目的】首創(chuàng)MHV-68干預(yù)老年吸煙小鼠所致CPFE模型,為進(jìn)一步MHV-68在CPFE形成中的可能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　【方法】48只清潔級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為8組,每組6只:A組(

5、正常對(duì)照組),B組(COPD組),C組:C1組(COPD+MHV68,7天),C2組(COPD+MHV-68,14天),C3組(COPD+MHV-68,21天),C4組(COPD+MHV-68,28天),D組(COPD+RSV,28天),E組(COPD+博來(lái)霉素組)。通過(guò)香煙煙霧熏染12月制造COPD模型,采用肺組織石蠟切片HE染色,肺泡灌洗液中總細(xì)胞計(jì)數(shù)及炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)肺組織病理變化及炎癥浸潤(rùn)情況,肺組織石蠟切片Masson染

6、色來(lái)評(píng)價(jià)肺組織膠原沉積情況。ELISA檢測(cè)纖維化相關(guān)重塑因子TGF-β1的蛋白表達(dá)水平。
　　【結(jié)果】肺組織切片HE染色可觀察到,與A組相比,其余各組均出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)的破壞,肺泡融合,肺大皰,在炎癥方面,E組炎癥最為顯著,C組次之,B組與D組的炎癥浸潤(rùn)較A組無(wú)明顯差別。在C組各亞組中可觀察到,相對(duì)C1組,C3,C4組的炎癥浸潤(rùn)顯著增多,C2組炎癥輕度增加。BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)可發(fā)現(xiàn),相對(duì)A組,其余各組肺泡灌洗液中的炎性細(xì)胞總數(shù)均顯著增

7、加,其中E組最高,C組次之,B組與D組之間無(wú)明顯差別。Masson染色可觀察到,與A組相比,C組與E組肺組織膠原沉積明顯增多,且E組膠原沉積較C組更為顯著,而A組,B組跟E組三者之間無(wú)明顯差異。ELISA結(jié)果提示,C組,E組小鼠BALF中TGF-β1的蛋白表達(dá)水平較A組明顯增加(P<0.05),B組,D組小鼠的TGF-β1較A組也有所增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,C組,E組的TGF-β1的增加較B組,D組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。<

8、br>　　【結(jié)論】MHV-68干預(yù)老年吸煙小鼠可以成功復(fù)制CPFE模型,不同時(shí)間段的病理改變提示所發(fā)生的纖維化可能與MHV-68對(duì)氣道的炎癥損傷及促使氣道重塑因子TGF-β1表達(dá)增多有關(guān),而RSV在體內(nèi)不能導(dǎo)致COPD小鼠形成CPFE的病理改變。
　　第三部分:糖皮質(zhì)激素DXM對(duì)MHV-68所致小鼠CPFE模型的影響
　　【目的】觀察DXM對(duì)MHV-68所致小鼠CPFE模型是否起到抑制作用,并分析其原因。
　　【方法】

9、12只清潔級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分成二組,每組6只(n=6):A組(COPD+MHV-68),B組(COPD+MHV-68+DXM)。采用肺組織石蠟切片HE染色,肺泡灌洗液中總細(xì)胞計(jì)數(shù)及炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)肺部炎癥浸潤(rùn)情況,切片Masson染色來(lái)評(píng)價(jià)肺組織膠原沉積情況。ELISA檢測(cè)纖維化相關(guān)重塑因子TGF-β1的蛋白表達(dá)水平。
　　【結(jié)果】肺組織切片HE染色及BALF炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)可觀察到,B組炎癥浸潤(rùn)程度較A組明顯減輕,Ma