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1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文強(qiáng)化融合蛋白Fv-LDP-AE體外活性研究及產(chǎn)生融合蛋白Fv-LDP的重組菌E.coli BL21(DE3)Star/pEFL高密度發(fā)酵姓名:高瑞娟申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:博士專業(yè):微生物與生化藥學(xué)指導(dǎo)教師:甄永蘇;李電東20060601中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士論文 中文摘要胞裂亡,其主要特征為:細(xì)胞體積增大,核增大、G 2 + M 期阻滯,細(xì)胞多核化等。H o e c h s t 3 3 3 4 2 和P I 雙染還可觀
2、察到一種與典型凋亡不同的染色質(zhì)凝集方式:核膜基本保持完整,細(xì)胞貼壁,染色質(zhì)散點(diǎn)狀凝集,形成多核,多核化細(xì)胞形態(tài)各異,發(fā)生頻率亦不相同。1n M F v —L D P —A E 致B E L 一7 4 0 2 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞裂亡的潛力較L D M 強(qiáng),可使7 1 %的細(xì)胞形成多核,而等濃度L D M 僅能使5 8 .0 %的細(xì)胞出現(xiàn)D N A 多倍性。對(duì)于同樣處理的P G 細(xì)胞,O .1 n M 的兩種藥物均能使大于4 0%的細(xì)胞多核化,但
3、隨著藥物濃度的升高,多核化細(xì)胞比例逐漸下降。藥物致P A a細(xì)胞多核化比例較低,最高達(dá)3 4 .8 %,等濃度F v - L D P —A E 較L D M 促進(jìn)細(xì)胞多核的效果好。這些結(jié)果說(shuō)明,多核化頻率因細(xì)胞種類不同而異。除裂亡外,0 .1 - 1n M F v .L D P .A E 和L D M 處理4 h ,繼續(xù)培養(yǎng)7 2 h 的P G 細(xì)胞和B E L 一7 4 0 2 細(xì)胞中還發(fā)生了細(xì)胞凋亡。大約2 0 %或更少的P G 細(xì)
4、胞凋亡,但瓊脂糖凝膠電泳未檢測(cè)到D N A 梯帶,提示凋亡的l a G 細(xì)胞可能處于早期階段。流式分析表明,與對(duì)照組相比,F(xiàn) v - L D P - A E 和L D M 處理的B E L - 7 4 0 2 細(xì)胞產(chǎn)生了典型的凋亡亞G 1 峰,在0 .1 .1a M 范圍內(nèi),F(xiàn) v —L D P —A E 致細(xì)胞凋亡百分比高于等濃度L D M ,且均隨藥物濃度增大而降低,瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)典型D N A 梯帶。P A a 細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)典
5、型的凋亡現(xiàn)象。F v —L D P - A E 和L D M 還影響細(xì)胞周期進(jìn)程。0 .1 n M F v —L D P - A E 和L D M 分別使5 6 .9 %和6 0 .7 %的P G 細(xì)胞阻滯于G 2 + M 期,而0 .5 n M 和1 n M 的F v —L D P - A E和L D M 則致P G 細(xì)胞阻滯于G 2 + M 期和s 期,其致s 期阻滯的最大百分比分別為6 9 .1 %和7 9 - 4 %。在0 .1
6、 —1n M 范圍內(nèi),F(xiàn) v —L D P —A E 和L D M 致P A a 細(xì)胞產(chǎn)生G 2 + M 期和s 期阻滯。本實(shí)驗(yàn)濃度處理的B E L - 7 4 0 2 細(xì)胞由于細(xì)胞大量凋亡和裂亡的影響,處于周期中的細(xì)胞較少,失去周期分析的可行性。S A —B —g a l 染色分析顯示,F(xiàn) v .L D P .A E 和L D M 作用過(guò)的細(xì)胞出現(xiàn)衰老樣表型,且二者對(duì)同種細(xì)胞的S A —B —g a l 染色陽(yáng)性率相仿,說(shuō)明其作用在腫
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