六聚組氨酸融合蛋白純化方法研究.pdf

1、六聚組氨酸(6xHis)是一種融合蛋白純化和檢測(cè)的常用標(biāo)簽，基于組氨酸與Ni<'2+>螯合作用，Ni-NTA(次氨基三乙酸)、Ni-IDA(亞氨基二乙酸)樹(shù)脂已被廣泛用于六聚組氨酸融合蛋白的純化。以羧甲基天冬氨酸(CM-ASP)為螯合配基的Co<'2+>螯合物對(duì)六聚組氨酸融合蛋白純化具有選擇性高、金屬離子不易脫落等特點(diǎn)。此外，通過(guò)抗6xHis抗體純化六聚組氨酸融合蛋白的方法受到了很多關(guān)注。本論文就六聚組氨酸融合蛋白的純化開(kāi)展了較為系統(tǒng)的

2、研究，內(nèi)容包括兩個(gè)方面：(1)合成了載有羧甲基天冬氨酸鈷離子螯合物的樹(shù)脂并建立了六聚組氨酸融合蛋白的純化方法。(2)制備了抗6xHis多克隆抗體，并初步將其用于六聚組氨酸融合蛋白的純化。 以Sepharose CL-6B為載體，環(huán)氧氯丙烷為活化劑，羧甲基天冬氨酸為螯合配基制備載有Co<'2+>的固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)(Co-CM-Asp-Sepharose)，將其用于六聚組氨酸融合蛋白的純化研究。優(yōu)化了200μL細(xì)胞裂解液中

3、六聚組氨酸融合蛋白純化所需介質(zhì)用量，Co-CM-Asp-Sepharose與細(xì)胞裂解液的孵育時(shí)間，介質(zhì)清洗溶液及靶蛋白洗脫液咪唑濃度等條件。比較了Co-CM-Asp-Sepharose與商品化Ni-NTA-Agarose(Qiagen公司)兩種螯合介質(zhì)對(duì)融合蛋白的純化效果。開(kāi)展了從5 mL細(xì)胞裂解液中純化六聚組氨酸融合蛋白CDl55D1的研究，并通過(guò)Bradford法測(cè)定了Co-CM-Asp-Sepharose對(duì)CDl55D1的純化量。

4、結(jié)果表明：對(duì)200μL細(xì)胞裂解液純化體系，Co-CM-Asp-Sepharose(50％懸浮液)的優(yōu)選體積為60μL，最佳孵育時(shí)間為30 min，洗脫液最佳咪唑濃度為200mmol/L。介質(zhì)用量放大為1.5 mL(50％懸浮液)從5 mL細(xì)胞裂解液中純化CDl55D1可達(dá)4.6 mg。與商品化Ni-NTA-Agarose相比，載有Co<'2+>的固定化金屬螯合親和層析介質(zhì)具有選擇性好，清洗條件簡(jiǎn)單，得到的靶蛋白純度高等優(yōu)點(diǎn)。 以

5、碳二亞胺(EDC)介導(dǎo)，將6xHis與載體匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)作為免疫原免疫新西蘭兔，所得抗血清經(jīng)飽和硫酸銨沉淀，得到純度高的抗6×His多克隆抗體。將多抗通過(guò)共價(jià)作用固定于氨基末端磁性微粒表面，以磁性微粒為載體通過(guò)免疫親和原理對(duì)六聚組氨酸融合蛋白CD155D1的純化進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明抗6xHis多克隆抗體可用于六聚組氨酸融合蛋白純化，但效率較低。除去多克隆抗體中針對(duì)載體蛋白的抗體是提高純化效率的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為此，通過(guò)免疫