重組ETEC K99蛋白和K88ac-STII融合蛋白的免疫原性研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxin Escherichia coli,ETEC)是引起幼畜腹瀉的主要病原之一,給畜牧業(yè)生產(chǎn)尤其是養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。研究表明,K88ac、K99菌毛和ST腸毒素是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌主要的致病因子,它們在幼畜腹瀉疫苗研制中具有重要的作用。 根據(jù)公布的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxin Escherichia coli,ETEC)的K99菌毛抗原的核苷酸序列(序列號:M3528

2、2)。設計特異性引物,通過PCR擴增得到K99菌毛抗原成熟肽基因,回收純化后將K99基因連于克隆載體pBS-T上,通過PCR、酶切鑒定、測序,證明其中含有K99基因片段,命名為pBS-K99。將鑒定結果正確的重組質粒和原核表達載體質粒pET-28a用Xhol/Ncol分別雙酶切,通過T4DNA連接酶將目的基因片段克隆入表達載體中,轉化入BL21(DE3)大腸桿菌中,經(jīng)IPTG誘導進行蛋白表達,SDS-PAGE、Western blott

3、ing檢測所表達的蛋白。 本研究在構建重組菌株BL21(DE3)(pET-28a-K99)和BL21(DE3)(pET28a-K88ac-STII)的基礎之上進一步作下述研究：采用IPTG誘導法分別對重組菌株BL21(DE3)(pET28a-K88ac-ST II)和BL21(DE3)(pET-28a-K99)進行誘導培養(yǎng)。SDS-PAGE凝膠電泳分析,重組菌株分別在約30KDa和18KDa處有特異性表達的蛋白條帶,與預期分子量

4、大小一致。在表達蛋白鑒定的基礎之上,通過透析的方法對目標蛋白進行初步純化回收。重復跑SDS-PAGE凝膠,切取目標蛋白條帶將其裝入特定孔徑大小的透析袋中繼續(xù)水平電泳,使得目標蛋白從凝膠中跑出,透析過夜后用PEG 6000調整定量蛋白的濃度約為3mg/mL,加入弗氏不完全佐劑作為重組蛋白疫苗。分別以重組蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔豬,優(yōu)化檢測免疫抗體水平的間接ELISA條件,通過比較三個免疫組的抗體水平來評價表達蛋白作為免疫抗原的有效

5、性。 經(jīng)IPTG誘導重組菌株BL21(DE3)(pET-28a-K99)進行蛋白表達,經(jīng)SDS-PAGE分析,結果表明：所表達的蛋白表達產(chǎn)物分子量大小為18KDa,且表達量較高,表達蛋白經(jīng)Western blotting檢測表明：表達的K99蛋白能和ETEC(C83912)免疫的兔血清發(fā)生特異性結合,證明其具有反應原性。以重組蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔豬,結果表明：重組蛋白免疫組、商品疫苗免疫組與PBS對照組抗體水平差異極