基于NF-κB信號通路研究熊果酸對MDR1 mRNA和P-gp表達的影響及其機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
  熊果酸(UA)具有多種藥理活性及廣闊的應用前景,但其口服生物利用度極低導致在臨床應用上受到限制。業(yè)已證實,P-gp的外排效應是引起UA口服生物利用度低的主要原因;而隨著UA濃度的增高,UA對P-gp外排活性的影響由抑制轉為誘導的研究結果卻令人倍感困惑。雖然UA通過抑制NF-κB信號通路的活性而發(fā)揮抗炎﹑抗病毒作用的研究早有報告;但UA對P-gp外排效應的影響究竟是抑制還是誘導,UA是否通過NF-κB信號通路而上下調控著

2、MDR1 mRNA和P-gp的表達,從而最終影響P-gp功能等疑惑至今尚未見國內外相關的研究報道,確應引起我們的密切關注和深入探究。因此,本課題基于NF-κB信號通路,從分子學水平探明UA對P-gp表達的調控機制,可為五環(huán)三萜類化合物轉運研究提供堅實的試驗和理論基礎。
  目的:
  通過建立穩(wěn)定及高表達MDR1 mRNA和P-gp的K562/ADR細胞模型,系統(tǒng)研究UA對MDR1 mRNA及P-gp表達的影響;基于NF-κ

3、B信號通路的NF-κB位點P65,深入地探討UA作用于MDR1 mRNA和P-gp的分子學機制。
  方法:
  1.以逐漸增大阿霉素濃度的方式誘導K562/ADR細胞的耐藥性,并最終以1.0μg/ml阿霉素維持細胞的耐藥性,按常規(guī)方法培養(yǎng)K562/ADR細胞,實驗前2周停藥,進行脫藥培養(yǎng),觀察細胞生長狀況,繪制細胞生長曲線。
  2.采用MTS法檢測阿霉素、PDTC和UA對K562/ADR細胞的體外毒性作用,選取細胞

4、存活率高于80%的條件進行后續(xù)實驗。
  3.以不同濃度NF-κB促進劑阿霉素或NF-κB特異性抑制劑PDTC為探針平行對照實驗,單獨或聯合作用于K562/ADR細胞模型48h后,運用RT-PCR、Western blotting等分子生物學方法檢測MDR1 mRNA和P-gp表達水平的變化,評價K562/ADR細胞模型MDR1 mRNA和P-gp的表達情況,以期為后續(xù)UA的研究建立穩(wěn)定且可靠的細胞模型。
  4.將不同濃度

5、UA單獨或聯合5μM阿霉素作用于K562/ADR細胞模型48h后,采用RT-PCR、Western blotting等分子生物學方法檢測MDR1 mRNA和P-gp表達水平的變化,評價UA對K562/ADR細胞MDR1 mRNA和P-gp表達的影響。
  5.基于NF-κB信號通路,將不同濃度UA﹑PDTC單獨或聯合5μM阿霉素作用于K562/ADR細胞模型48h后,提取細胞中的胞核蛋白,采用Western blotting免疫印

6、跡法檢測胞核蛋白P65表達水平的變化;深入探究UA對調控MDR1 mRNA和P-gp表達的上游調控位點NF-κB P65表達的影響。
  6.數據處理與統(tǒng)計分析:各個實驗組的數據都以均數土標準差(mean±SD)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行方差齊性檢驗﹑單因素方差分析(One-way ANOVA)及相關分析,各組之間的比較采用LSD法;結果以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義,P>0.05表示差異無統(tǒng)計學意義。
 

7、 結果:
  1. NF-κB促進劑0.5~15μM阿霉素作用于K562/ADR細胞48h后,MDR1 mRNA的表達分別上調了14.26%、31.58%、39.32%、46.9%﹑62.37%;P-gp的表達分別上調了12.41%﹑22.63%﹑34.31%﹑43.8%﹑57.66%;0.5~15μM阿霉素能明顯上調MDR1 mRNA和P-gp的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在0.5~15μM濃度范圍內,阿霉素對MD

8、R1 mRNA和P-gp表達的促進作用均隨濃度的增加而增強(R2=0.8110;R2=0.8901)。
  2.特異性抑制劑5~100μM PDTC作用于K562/ADR細胞48h后,MDR1 mRNA的表達分別下調了16.81%、32.74%、43.36%﹑54.87%﹑66.37%;P-gp的表達分別下調了29.02%﹑45.85%﹑64.51%﹑74.61%﹑82.12%;5~100μM PDTC能明顯下調MDR1 mRNA

9、和P-gp的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在5~100μM濃度范圍內,PDTC對MDR1 mRNA和P-gp表達的抑制作用均隨濃度的增加而增強(R2=0.7708;R2=0.6583)。
  3.當5μM阿霉素時,抑制劑PDTC濃度為5~50μM作用于K562/ADR細胞48h后,25μM PDTC和50μM PDTC分別使MDR1 mRNA的表達下調了26.60%﹑48.94%;P-gp的表達下調了35.73%﹑48

10、.7%;25μM、50μM PDTC可明顯下調阿霉素誘導的MDR1 mRNA和P-gp的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
  4.與空白組相比,5~50μM UA作用于K562/ADR細胞48h后,MDR1 mRNA的表達分別下調了9.04%﹑15.58%、28.75%﹑44.21%;P-gp的表達分別下調了23.36%、37.23%、43.07%﹑64.23%;10~50μM UA明顯下調MDR1 mRNA的表達,5~

11、50μM UA明顯下調P-gp的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在5~50μM濃度范圍內,UA對MDR1 mRNA和P-gp表達的抑制作用均隨濃度的增加而增強(R2=0.9636;R2=0.8310)。
  5.在促進劑5μM阿霉素存在下,5~50μM濃度的UA作用于K562/ADR細胞48h后,10μM UA﹑25μM UA和50μM UA分別使MDR1 mRNA的表達下調了24.06%﹑28.72%﹑34.53%;P

12、-gp的表達下調了20.96%﹑24.36%﹑31.2%;5~50μM UA能明顯抑制阿霉素誘導的MDR1 mRNA和P-gp的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
  6.針對MDR1 mRNA/P-gp調控研究表明,5~50μM UA作用于K562/ADR細胞48h后,其上游調控核蛋白P65表達分別下調了13.73%﹑28.92%﹑44.07%﹑56.77%,而特異性抑制劑PDTC在5~100μM濃度范圍內,P65的表達

13、分別下調了23.66%﹑39.8%﹑53.76%﹑65.59%﹑80.65%;且對P65表達的抑制作用均隨UA和PDTC濃度的增加而增強(R2=0.8924,R2=0.7548)。
  7.在促進劑5μM阿霉素存在下,5~50μM濃度 UA和PDTC作用于K562/ADR細胞48h后,10μM UA﹑25μM UA和50μM UA使核蛋白P65的表達分別下調了32.62%﹑36.9%﹑45.45%,25μM PDTC和50μM P

14、DTC分別使P65的表達下調了42.86%﹑56.98%;UA和PDTC在相同的線性范圍內5~50μM均能明顯抑制阿霉素誘導的P65的表達。
  結論:
  1.本研究建立的K562/ADR細胞模型能穩(wěn)定特異性高表達MDR1 mRNA及P-gp,可為基于NF-κB P65位點研究UA對MDR1 mRNA及P-gp表達的影響提供適宜且可靠的細胞模型。
  2. UA在基因和蛋白水平上明顯抑制K562/ADR細胞模型中MD

15、R1 mRNA和P-gp的表達,與NF-κB通路激活的特異性抑制劑PDTC作用相似,且對抗促進劑阿霉素的誘導作用,提示其抑制效應機制可能為UA抑制了NF-κB信號通路的活性。
  3. UA明顯抑制K562/ADR細胞模型中MDR1 mRNA和P-gp的上游調控信號通路NF-κB位點核蛋白P65的表達;有促進劑阿霉素存在時,仍與作用于NF-κB位點P65的抑制劑PDTC抑制效應相同,提示UA對MDR1 mRNA和P-gp表達的抑制

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