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文檔簡介
1、剛地弓形蟲是一種頂復門專性細胞內寄生原蟲,是非常重要的人獸共患病原體。弓形蟲生活史復雜,宿主范圍廣泛,能感染包括人在內的幾乎所有溫血動物。弓形蟲一直作為了解宿主免疫系統(tǒng)抵抗細胞內病原體的重要的模式生物。NF-κB信號通路被認為在調節(jié)對抗弓形蟲的宿主初級和獲得性免疫反應中有著重要的地位。近年來,一系列弓形蟲抗原被發(fā)現能夠調控宿主NF-κB信號通路,但它們的具體機制尚不明確。
本研究首先檢測5株不同弓形蟲速殖子對宿主NF-κB信號
2、通路的影響;然后利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測了22種弓形蟲抗原對NF-κB信號通路的激活效應,發(fā)現GRA15能激活NF-κB信號通路,進而對其激活通路的具體分子機制進行了探索。
1)不同株弓形蟲速殖子對NF-κB信號通路的影響
將RH、Me49、VEG、地方Ⅰ型和地方Ⅱ型弓形蟲速殖子感染HEK293T細胞,利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測它們不同感染豐度下對NF-κB信號通路的影響,發(fā)現Me49、VEG、地方Ⅰ型和地方Ⅱ型弓
3、形蟲能激活NF-κB信號通路,RH株弓形蟲對NF-κB信號通路有非常明顯的抑制效應。
利用間接免疫熒光試驗評估5種弓形蟲速殖子入侵細胞的能力,選取有相似入侵量時的感染豐度進行比較,發(fā)現這些弓形蟲速殖子對NF-κB信號通路的影響存在差異。
2)激活NF-κB信號通路的弓形蟲抗原的篩選
將22種弓形蟲抗原真核表達質粒分別轉染HEK293T細胞,利用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測發(fā)現僅有pCMV-GRA15(Ⅱ)和pCMV-
4、GRA15(Ⅰ)能夠激活NF-κB信號通路。
利用Western blot和IFA分析表達了Ⅰ型GRA15蛋白的宿主細胞,發(fā)現細胞內p65磷酸化水平顯著提高,并發(fā)生核轉移現象,驗證了Ⅰ型GRA15能夠激活NF-κB信號通路。
3) GRA15激活NF-κB信號通路的分子機制
根據生物信息學分析,全長的GRA15存在著兩種結構域,跨膜區(qū)和核定位信號。因此構建了7個不同長度的GRA15截短真核表達質粒(pCMV
5、-GRA15-1、pCMV-GRA15-2、pCMV-GRA15-3、 pCMV-GRA15-4、 pCMV-GRA15-5、pCMV-GRA15-6和pCMV-GRA15-7),將它們分別轉染HEK293T細胞,利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測到pCMV-GRA15-4、pCMV-GRA15-5、pCMV-GRA15-6和pCMV-GRA15-7均有激活NF-κB信號通路的作用,推測Ⅰ型GRA15的194-518氨基酸區(qū)域為激活NF-κB信
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